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摘要：明确大蒜有机硫化物(Garlic organic sufide,GOS)对豆杆优势腐败解淀粉芽孢杆菌生物膜抑制效果及抑制机理。方法：通过分析GOS处理后解淀粉芽孢杆菌生物膜形成量，膜内活菌数变化，并结合菌体颤搐性变化探讨GOS对解淀粉芽孢杆菌生物膜的抑制机理。结果：GOS对解淀粉芽孢杆菌DY1a、DY1b生物膜均有抑制作用。结论：大蒜有机硫化物对解淀粉芽孢杆菌生物膜抑制作用明显，其抑制机理与菌体动力学特性有关。
关键词：大蒜有机硫化物;解淀粉芽孢杆菌;生物膜
1前言
本实验以解淀粉芽孢杆菌DY1a、DY1b为实验菌株，通过改变大蒜有机硫化物添加量，观察其表面生物膜生长情况，通过测定形成量及膜内活菌数，研究大蒜有机硫化物是否抑制解淀粉芽孢杆菌生物膜形成，根据大蒜有机硫化物对菌体动力学特性影响，探讨其抑制机理，为大蒜有机硫化物推广提供一定的理论基础。
2材料与方法
2.1材料
解淀粉芽孢杆菌DY1a、DY1b，保藏于四川农业大学食品学院。大蒜提取物，实验室制备。
2.2主要试剂
主要培养基：LB培养基，TSB培养基，PCA培养基等。
主要试剂：无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、结晶紫、甲醇、NaOH、HCl
2.3大蒜提取物的制备
称取450 g剥皮去蒂洗净的蒜瓣，按1：4的料液比加入75%的乙醇，用打浆机进行破壁处理，将破壁的蒜泥置于40℃水浴锅中酶解30 min后超声90 min辅助提取，设为最大功率并保持40℃。对超声后的大蒜液进行抽滤，取滤液于旋转蒸发仪上蒸发浓缩，将浓缩后的大蒜提取液用无菌水定容至150 mL，置于冰箱中保藏待用。
2.4大蒜有机硫化物对芽孢杆菌生物膜抑制效果
配置制大蒜有机硫化物浓度为0、1/4 MIC、1/2 MIC、3/4MIC、MIC的TSB豆浆培养基,分别向其接种培养24 h的细菌菌悬液，调节菌液浓度至106 CFU/mL并分装30 mL至无菌烧杯中，用无菌保鲜膜封口，37.°C静置培养48 h。每隔12 h,定性观察并拍照，记录细菌生长状况。
2.5大蒜有机硫化物对芽孢杆菌生物膜抑制作用
配置制大蒜有机硫化物浓度为0、1/4 MIC、1/2 MIC、3/4MIC、MIC的TSB豆浆培养基,接种培养24 h的细菌菌悬液，浓度106 CFU/mL并分装30 mL至无菌烧杯中，用无菌保鲜膜封口，37°C静置培养48 h。每隔12 h，定性观察并拍照，记录细菌生长状况。培养48 h后，按照定量分析的步骤进行生物膜形成量测定,并计算大蒜有机硫化物对细菌生物膜形成量的抑制率，计算公式如下。
抑制率(%)=*100%
2.6生物膜内活菌数的测定。
配置配制大蒜有机硫化物浓度为0、1/4 MIC、1/2 MIC、3/4MIC的TSB豆浆培养基，分别向其接种培养24 h的细菌菌悬液，调节菌液浓度至106 CFU/mL并分装3mL至24孔细胞培养板中，37°C静置培养48 h。培养完成后，用3 mL无菌PBS缓冲液轻洗生物膜3次，用细胞刮刀完整地取下生物膜并将其转移到15 mL无菌离心管中，再向离心管加入10 mL无菌PBS缓冲液，超声波震荡10 min。梯度稀释后，取10 uL稀释液均匀涂布于PCA平板中，37°C培养24 h后观察计数。
2.7细菌颤搐能力的测定。
根据郭锦锦[19]的方法稍作修改，待颤搐琼脂培养基凝固后，用无菌牙签蘸取单菌落，刺入颤搐琼脂培养基(刺到底) , 移至37 °C培养箱中静置培养24 h。培养完成后，用细胞刮刀取下琼脂培养基。向平板中加入1%结晶紫溶液染色25 min。染色完成后弃去染液，用无菌PBS缓冲液清洗平板2次，观察并拍照，测量染色圈的大小，计算大蒜有机硫化物对细菌颤搐能力的抑制率，公式参照2.5中的公式。
2.8生物膜内活菌数的测定。
配置配制大蒜有机硫化物浓度为0、1/4 MIC、1/2 MIC、3/4MIC的TSB豆浆培养基，分别向其接种培养24 h的细菌菌悬液，调节菌液浓度至106 CFU/mL并分装3mL至24孔细胞培养板中，37°C静置培养48 h。培养完成后，用3mL无菌PBS缓冲液轻洗生物膜3次，用细胞刮刀完整地取下生物膜并将其转移到15 mL无菌离心管中，再向离心管加入10 mL无菌PBS缓冲液，超声波震荡10 min。梯度稀释后，取10 uL稀释液均匀涂布于PCA平板中，37°C培养24 h后观察计数。抑制率计算参照2.5中的公式。
3结果与分析
3.1解淀粉芽孢杆菌在大蒜有机硫化物处理下生物膜形成量的变化
结果说明，大蒜有机硫化物能够有效抑制解淀粉芽孢杆菌生物膜的形成，解淀粉芽孢杆菌DY1b在生物膜形成过程中对大蒜有机硫化物的抵抗能力强于DY1a。
3.2解淀粉芽孢杆菌在大蒜有机硫化物处理下膜内活菌数的变化
结果，可以发现大蒜有机硫化物对解淀粉芽孢杆菌DY1a的抑制率高于解淀粉芽孢杆菌DY1b，与之前的结论一致。
3.3解淀粉芽孢杆菌在大蒜有机硫化物处理下颤搐性的变化
结果显示，大蒜有机硫化物对两株解淀粉芽孢杆菌颤搐能力有明显的抑制效果,对解淀粉芽孢杆菌DY1a的抑制效果更好，见图一。
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图1 不同大蒜有机硫化物浓度下腐败菌颤搐能力的变化（a）、颤搐圈的大小（b）与颤搐能力抑制率（c）
注：A：解淀粉芽孢杆菌DY1a；B：解淀粉芽孢杆菌DY1b。（b）中相同浓度组不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。（c）中相同菌株不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
4结束语
解淀粉芽孢杆菌DY1a与DY1b可分泌由胞外多糖为主要成分的胞外粘性基质，形成生物被膜。生物被膜对被膜内的细菌有着非常重要的保护作用。本研究证实了大蒜有机硫化物对解淀粉芽孢杆菌生物膜的形成具有抑制效果，这种抑制机理可能与干扰细菌运动能力有关。大蒜有机硫化物在控制预浸泡豆杆优势腐败菌中具有较强的应用潜力。
参考文献
[1]崔海英,周慧,刘延涛,等.丁香精油对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用研究[J].中国食品添加剂,2015(12):55-59.
[2]张宪龙.生物膜生长动力学建模研究[D].武汉：武汉大学, 2016.
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