孙潇茜
学校： The Stony Brook School 邮编： 11790
左旋肉碱（L-carnitine，L-car，(R)-3-羟基-4-三甲基氨基丁酸酯）是一种在生命体中特别是动物肌肉组织中高浓度存在的季胺化合物，以其突出的脂肪代谢功能引起了广泛的研究。
左旋肉碱首次发现于1905年，50年后微生物中左旋肉碱的代谢途径被逐渐揭露，在细菌中，肉碱可以作为最终的电子受体、相容的溶质、唯一的碳源和氮源，以及渗透压保护剂。哺乳动物中左旋肉碱主要参与脂肪代谢、释放能量，它辅助激活形态的长链脂肪酸从细胞质基质中运到到线粒体基质发生β氧化。人体中95%的左旋肉碱存在于骨骼肌和心肌中，剩下的5%在血液系统中循环(!!! INVALID CITATION !!! (Cave et al., 2008); Cave et al., 2008)。75%左旋肉碱的获得来自饮食，比如红肉是最好的左旋肉碱补充食品，也可以从鱼、牛奶中获得，剩下的25%左旋肉碱则是生物体利用L-赖氨酸、L-蛋氨酸内源合成。
左旋肉碱在食品工业、饲料工业、医药工业等领域都有着非常广泛的应用。在食品工业中，由于左旋肉碱重要的脂肪代谢能力，被用作瘦身减肥产品的主要有效成分；婴幼儿合成左旋肉碱的能力只有成年人的15%左右，而左旋肉碱对于婴儿脑部发育至关重要；研究表明左旋肉碱还具有提高身体耐受性、提高肌肉量、降低血脂、强心等功能，所以左旋肉碱也在运动食品与老年保健品中被广泛添加。在饲料工业中，左旋肉碱具有促进生猪的生长、提高瘦肉率、平衡不同氨基酸的吸收程度的作用，故而被应用于家禽家畜的养殖及牲畜饲料的添加。在医药工业中，左旋肉碱可用于治疗尿毒症贫血，缓解内毒素血症保护肝脏受损，提高精子活力治疗女性不孕症等，得到了全世界医药行业的密切关注，并不断开发应用到各种疾病治疗当中。
因此，左旋肉碱常被用作添加剂加入减肥产品、保健产品以及牲畜饲料，左旋肉碱的需求正日益上升。
目前左旋肉碱的合成方式主要有化学合成法和生物合成法，其中化学法具有对原料要求苛刻、步骤繁琐、操作困难等缺陷，但因其纯度高，易分离，是目前工业生产左旋肉碱的主要途径；生物法主要利用大肠杆菌、酿酒酵母等模式菌株，经过多酶催化反应，可逆地得到左旋肉碱。生物法相较化学法具有易于操作、环境友好等优点，但是转化率和纯度较低，尚且达不到工业生产的要求，给后期的分离纯化带来了一定的困难。
因此，建立一个绿色高效的左旋肉碱合成工艺就变得尤为重要。
2. 国内外本学科领域的发展现状与趋势
2.1左旋肉碱的化学合成方法
（1）消旋体拆分法
早期化学合成的肉碱是外消旋体，是以环氧氯丙烷为原料，经过氨化、酸化、氰化、水解及去离子化得到的，后来发现右旋肉碱会对肉碱乙酰转移酶和肉碱脂肪酰转移酶有竞争性抑制作用，研究人员开始用D-樟脑磺酸、二苯甲酰-D-酒石酸等对DL-肉碱进行拆分。
（2）手性原料合成法
手性原料化学合成法主要采用自然界中存在并且易于获取的手性物质为原料，直接合成左旋肉碱。
（3）不对称合成法
不对称合成法直接利用潜手性物质转化为目标产物，从而避免手性拆分，提高原料的利用率。经典的不对称合成法以4-氯-3-羰基丁酸烷基酯为原料，不对称催化制取中间产物（R）-4-氯-3-羟基丁酸烷基酯，然后经过三甲胺化、酸化、水解等步骤制取左旋肉碱。
2.2化学法合成左旋肉碱的研究现状
（1）基于消旋体拆分法
钱伟等发明了一种在微反应器内进行的左旋肉碱的连续化制备方法，以（S）-环氧氯丙烷为原料，进行三甲胺胺化反应、氰化反应、盐酸纯化等步骤，通过三个微反应器的不断分离纯化，最后结晶得到高纯度的左旋肉碱。5.2kg（S）-环氧氯丙烷可以得到8.0kg左旋肉碱，产物选择性高达95%[18]。
（2）基于手性原料合成法
Mccarthy等人以（S）-羟基-γ-丁内酯为原料两步法获得左旋肉碱，转化率达到95%。
（3）基于不对称合成法
孙建华等发布专利以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料，经硼氢化还原反应、固定化脂肪酶催化、不对称酯化反应、三甲胺缩合反应，最后水解得到左旋肉碱。该方法以10.2g酯化物和40g三甲胺水溶液为起始，与90-100℃的乙醇共浴反应5h，经过一系列分离纯化可以得到6.8g左旋肉碱，纯度达99%，收率86.2%。
化学合成法先制取出外消旋肉碱，然后拆分获得左旋体。美国食品药品监督管理局于1993年禁止销售D型和DL型（混旋型）肉碱，在制药和保健品配方方面，2006年欧洲药典和2008年美国药典分别对其旋光性进行测定，因此通过化学拆分DL-肉碱生产L-肉碱的方法要求更为苛刻，并且化学合成法环境污染大，大量的废弃副产物D-肉碱造成资源浪费。
2.3左旋肉碱的生物合成方法（左旋肉碱的代谢途径）
（1）三甲基赖氨酸四步酶反应
Candida albicans、Neurospora crassa及部分真核生物经过蛋白降解得到前体物质三甲基赖氨酸，并在四种酶的催化下合成左旋肉碱[21, 22][21]{Bremer, 1983 #69;!!! INVALID CITATION !!! , #0;, 2009 #72}。首先在羟化酶的作用下，三甲基赖氨酸被羟化得到3-羟基三甲基赖氨酸，接着醛缩酶将其裂解为4-三甲基氨基丁醛和甘氨酸，然后发生脱氢反应产生直接前体物质γ-丁基甜菜碱（γ-BB），最后在羟化酶的作用下合成左旋肉碱。
（2）γ-BB羟化反应
Sinorhizobium meliloti、Pseudomonas中存在一个编码γ-BB羟化酶（BBH）的基因bbh，该酶是一种α-酮戊二酸（2-OG）依赖型的双加氧酶，在有氧条件下以Fe2+作为辅因子一步催化合成左旋肉碱[23, 24]{Lu, 2012 #78;Bazire, 2019 #79;Lu, 2012 #60}。
（3）巴豆甜菜碱及右旋肉碱酶催化反应
在 Escherichia coli.中左旋肉碱有两种合成途径，分别以巴豆甜菜碱和右旋肉碱作为前体物质。fix和cai是大肠杆菌中与左旋肉碱代谢密切相关的基因簇，fix编码的蛋白负责将电子传递给CaiA，活化的CaiA会激活巴豆甜菜碱的还原，在CoA及其转移酶的帮助下最终合成左旋肉碱，cai还会编码一个关键的转运蛋白CaiT，巴豆甜菜碱、γ-BB和左旋肉碱均从这个通道进出细胞；左旋肉碱也可以在消旋酶的作用下由右旋肉碱合成。
2.4生物法合成左旋肉碱的研究现状
（1）三甲基赖氨酸四步合成法
对于Neurospora crass这种已经存在三甲基赖氨酸合成左旋肉碱途径的的菌株来说，可以直接增加相关酶的表达强度，从而提高左旋肉碱的产量；Franken等将这种途径引入了酿酒酵母中，以TML为前体合成左旋肉碱，转化率为0.4%，以γ-BB为前体时转化率达到58%，首次展现了酿酒酵母生产左旋肉碱的潜力。
（2）γ-BB羟化法
以γ-BB为前体，一步羟化生成左旋肉碱是一种非常便捷且高效的合成方式，杨月英等构建了Pseudomonas pf5?cdh/bbh，敲除了假单胞菌的左旋肉碱代谢途径，加强羟化酶的表达，在γ-BB转化液中得到1.2g/L左旋肉碱；卢向峰等在大肠杆菌中成功克隆表达了来自Pseudomonas. sp L-1的bbh，重组大肠杆菌静息细胞左旋肉碱产量可达12.8mM。
（3）巴豆甜菜碱CoA依赖型合成法
巴豆甜菜碱还原合成左旋肉碱是目前生物法中应用最多的合成方式。杨月英等人构建了E.coli BW25113?aceK/28a-caiBCD+PACYCD-caiT-caiF，在20g/L巴豆甜菜碱盐酸盐转化液中进行转化，4h后得到2.219g左旋肉碱，转化率达13%。
Paula Arense等基于大肠杆菌中巴豆甜菜碱的还原途径，构建BW ΔaceK ΔcaiA p37cai，该菌株以巴豆甜菜碱为前体，外加富马酸作为电子受体，静息状态下厌氧转化，得率可达59.6 mmolL-1 h-1，且几乎没有副产物γ-BB的生成
而Jingqiang Tian等使用中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保存的Proteus mirabilis以[Bmim]PF6离子液体为反应介质，在肉碱脱水酶的作用下，通过巴豆碱的水化合成L-肉碱。用脂肪酶将左旋肉碱转化为棕榈酰左旋肉碱，并不断用叔戊醇提取，在可逆的水化反应中，巴豆甜菜碱继续生物转化为L-肉碱，总摩尔收率可达87.2%。
Meyer等报道了一种从γ-BB出发CoA依赖型四步法合成左旋肉碱的方式，并且被Lonza扩大化，连续发酵的产率远远高于分批发酵（130gL-1d-1 vs 30gL-1d-1），但是转化率情况则相反（91%vs99.5%），纯度降低造成分离成本提高40%，Lonza最后选择分批发酵进行工业化生产。
（4）右旋肉碱消旋法
右旋肉碱作为一种手性工业废品是合成左旋肉碱的良好前体，Castellar等利用Escherichia coli O44 K74以右旋肉碱为前体合成左旋肉碱，当细胞生物量为4.3g/L，底物浓度为100mM时左旋肉碱产率可达0.55gL-1 h-1，转化率为44%[34]。
综上，左旋肉碱的生物合成研究已经取得了一系列的进展，但是仍存在一些问题有待进一步解决。左旋肉碱的生物合成大多是多步酶促反应，有可逆反应，且普遍存在左旋肉碱降解途径，造成了转化效率降低；各研究主要通过改变细胞通透性的方式辅助产物与底物的运输，转运效率较低也会造成左旋肉碱产量的下降；而一步法羟化得到左旋肉碱的合成方式中BBH是2-OG依赖性加氧酶，需要2-OG作为共底物，2-OG是微生物TCA循环的重要中间产物，是众多生长必须氨基酸的前体物质，羟化反应与TCA途径的2-OG竞争会造成菌株的生长受限，进而造成生长与产物合成的不平衡。本研究拟利用BBH一步羟化法重构大肠杆菌TCA循环，增强左旋肉碱转运系统，阻断左旋肉碱代谢途径，解决左旋肉碱生物合成中依然存在的问题。
3.课题主要研究内容及预期目标
本研究拟通过外源引入BBH构建外源L-car合成途径，通过增强转运系统，底盘敲除大肠杆菌自身的L-car代谢途径，优化L-car的合成。由于BBH为2-OG依赖型加氧酶，需要2-OG、氧气作为共底物，反应生成琥珀酸和二氧化碳，而2-OG到琥珀酸正是大肠杆菌TCA途径中至关重要的步骤，拟通过重构TCA循环，将2-OG由共底物变为辅因子，提高BBH合成L-car的效率，获得高效合成左旋肉碱的大肠杆菌工程菌。以工程菌为全细胞催化剂，通过全细胞催化条件的优化，获得全细胞催化生产左旋肉碱的工艺，实现左旋肉碱的高效绿色生物合成。
3.1课题主要研究内容
（1）外源引入BBH构建L-car合成途径。
（2）L-car合成途径的优化：增强转运系统，底盘敲除大肠杆菌自身的L-car代谢途径。
（3）重构TCA循环，将2-OG由共底物变为辅因子，提高BBH合成L-car的效率，获得高效合成左旋肉碱的大肠杆菌工程菌。
（4）以工程菌为全细胞剂，通过全细胞催化条件的优化，获得全细胞催化生产左旋肉碱的工艺。
参考文献
1. 钱伟, 施裕华, 彭智勇, 谢南生, 陆建军, 文春林, 刘明, 顾文雅: 一种左旋肉碱连续化生产装置. In.; 2020.
2. 孙建华, 张亚, 徐斌: 一种高光学纯L肉碱的制备方法. In.; 2017.