余超，韦长林，王树东
合肥工业大学土木与水利工程学院，安徽合肥230009）
摘要：给水管网中微生物在面对不断变化的环境条件会倾向于附着在管壁表面形成生物膜以抵御不利环境的影响，直接威胁供水安全。以给水管网微生物为研究对象，构建静态模拟实验装置，借助死活染色、Lowry蛋白法、硫酸蒽酮法等分析方法来探究不同管材类型对生物膜形成的影响。结果表明，同等粗糙度条件下不同管材表面附着的生物量大小为PVC＞铸铁＞PE＞不锈钢。
关键词：给水管网；管材；生物量；胞外聚合物
给水管网系统内部是一个复杂的、动态变化的微生物生态系统，其中蕴含的一系列物理、化学和生物变化过程给水质带来的不良影响，会直接威胁供水水质安全[1]。给水管网的管材对生物膜的形成有重要影响，研究表明，一些管道材料可以降低消毒剂的灭菌作用，从而导致微生物在管道表面附着生长形成生物膜。微生物能够腐蚀金属管材内壁形成腐蚀层为微生物的增殖提供场所，此外消毒剂的消毒效果在腐蚀层内显著性降低[2]。尽管如此，目前有关管材对生物膜形成的影响还有很多不清晰的地方。本实验以市政管网中的自来水为研究对象，构建静态模拟实验装置观测不锈钢、PE、PVC、铸铁四种材质对生物膜形成的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
LIVE/DEAD染液，赛默飞世尔科技；硫酸、蒽酮，分析纯，国药集团；Lorry低蛋白试剂，0.1～50 μg/mL，荔达公司；生理盐水（0.9%，国药集团）。TH4-200荧光显微镜，日本奥林巴斯；CP214电子天平，上海奥豪斯；UV2006紫外分光光度计，上海尤尼科。
1.2 实验设置
为研究不同管材对生物膜形成过程的影响，本实验使用烧杯作为反应器，采用市政管网自来水作为实验用水。制作四种管材的载片，其大小为长×宽×高：30 mm × 12 mm × 2 mm，粗糙度相近。使用无水乙醇清洗3 min，再用超纯水润洗两遍，放入121oC高压蒸汽灭菌锅中灭菌15 min，之后放入超净工作台上进行自然晾干，备用，同时避免杂菌污染。将不同管材的载片分别置于不同的烧杯中，在每个烧杯中加入500 mL市政管网自来水，烧杯口用锡箔纸覆盖。在培养1 d、6 d、14 d后进行取样，进行生物膜生物量、胞外聚合物和水质指标的测定。每个取样时间点在烧杯中各取30 mL水样，用于水质参数的测定。为保证实验的准确性，以上每组实验均设置3组平行样进行测定，并重复3次。
1.3 微生物的提取
在每个取样时间点，取出烧杯中的载片，使用0.9%无菌生理盐水小心冲洗，去除未附着的微生物[3]。然后，将载片放入装有 5 mL 缓冲溶液的试管中，在 40 kHz下超声 20 min，使载片上附着的微生物以及生物膜均匀分散在缓冲溶液中[3, 4]，得到均匀的生物膜细菌悬浮液。
1.4 细菌量的测定
分子探针LIVE/DEAD细菌活性试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Oregon，USA）用于区分生物膜样品中的活细胞和死细胞[5-7]。具体操作过程为：取3 μLPI（Propidium iodide，2 mMol）和3 μLSYTO 9（0.33 mMol）加入5.0 mL的样品中，在室内避光染色30 min，将染色后的样品通过直径为25 mm孔径为0.22 μm的黑色聚碳酸酯膜[8]，截留细菌的滤膜置于荧光显微镜下进行观察，在200倍下随机选取10个视野进行细菌计数。
1.5 胞外聚合物的提取及测定
胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS）提取采用加热法，生物膜悬浮液和水样各取10 mL样品， 80oC水浴加热30 min，再通过0.22 μm滤膜过滤，滤液即为待测溶液。多糖采用蒽酮法，在625 nm波长下用紫外分光光度计（UV-2600，尤尼柯，上海）测定各待测液分光光度值，用葡萄糖作标准曲线；蛋白采用 Folin-Lowry法，在750 nm波长下用紫外分光光度计测定各待测液分光光度值，用牛蛋白血清作标准曲线。
2 结果与分析
2.1 管材对载片表面生物膜上生物量的影响
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图1为不同管材表面生物膜中生物量随时间的变化趋势，管材和取样时间均对附着的生物量有显著的影响。随着反应时间的增加，生物膜中生物量呈不断上升的趋势。PVC管材表面附着的生物量在14d内增长了0.957×106 cells/cm2，其他三种管材与此类似。在生物膜附着的初期，四种管材表面附着的生物量相差较小；在第14 d天时，表面附着生物量最多的PVC载片的生物量为6.829×106 cells/cm2，最少的STS管材表面生物量为3.218×105 cells/cm2。管材类型对生物膜的形成速率有着明显的影响，不同管材表面附着生物量大小为PVC＞铸铁＞PE＞不锈钢。
2.2管材对微生物胞外聚合物的分泌的影响
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图2为在不同管材和粗糙度条件下生物膜上胞外聚合物的变化。由此可知，四种管材表面微生物所分泌的EPS量均随反应时间的增加而上升。随着反应时间的推移，在四种管材中，PVC表面EPS分泌量变化最为显著，在PVC管材中第14 d微生物所分泌的EPS含量约为第1 d的1.88倍。在第14d时不锈钢、PE、PVC、铸铁四种管材中EPS含量分别为18.284 μg/lg(cells)、14.059 μg/lg(cells)、25.627 μg/lg(cells)、25.535 μg/lg(cells)。PVC载片表面的EPS含量最高，CI载片表面的EPS含量和PVC相接近。可见微生物在应对外界环境变化时，会分泌更多的胞外聚合物以利于自身的生长。
2.3 管材对主体水中生物量的影响
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图3为主体水中生物量随时间的变化。其中进水采用市政管网自来水进水其生物量为2652 cells/mL。随着时间的推移，在14 d内四种管材所在的反应器中的生物量均不断增加，STS管材所在的反应器中的生物量在第1 d时为3.253×104 cells/mL，第14 d时增加到4.024×105 cells/mL，其生物量在14 d内增加了12.37倍。值得注意的是，在前10 d水中的生物量增长较快，之后则较为缓慢，这可能是由于水体中有机物逐渐被消耗，延缓了微生物的生长。
3 结论
给水管网中的不同管材表面附着生物量大小为PVC＞铸铁＞PE＞不锈钢，微生物在形成生物膜的过程中所分泌的胞外蛋白（PN）和多糖（PS）对微生物的聚集和附着行为发挥了重要作用，面对外界环境变化时微生物会分泌胞外聚合物以利于自身附着。
参考文献
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