陈伟
云南省宣威市第一中学（655400）
人教版高中生物教材选修3——《现代生物科技专题》中讲到了PCR技术。内容很少讲得很浅，读完教材仍然存在很多疑问，且只靠教材内容也不能解答一些相关试题。笔者现对PCR技术中的一些细节作出释疑。
PCR是聚合酶链式反应的英文缩写。是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术是由穆里斯等人于1988年发明的，穆里斯本人也因此项发明荣获1993年诺贝尔化学奖。
PCR技术的实质是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。这一技术可用于扩增目的基因、亲子鉴定、侦测遗传病、基因图谱建立等方面。为了降低难度，高中教材对DNA的复制过程讲得比较浅，没有提及引物、dNTP（脱氧核苷三磷酸）等内容。而教材在介绍PCR技术时却提到了这些物质，造成了学生的理解困难。要弄清PCR的过程，先要清楚细胞内DNA的复制过程。
DNA的复制是一个复杂的过程，粗略的讲是这样进行的：母本DNA分子在解旋酶的作用下，利用ATP水解提供的能量，将双链打开。解开的两单链区很快和单链附着蛋白结合，防止两单链区重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。之后解开的两单链在引物酶的作用下，在复制起点处合成RNA引物，接着由DNA聚合酶从RNA引物3＇端开始合成新的DNA链。由于DNA聚合酶的合成方向都是5＇→3＇，因此，以3＇→5＇的母链为模板链时，DNA聚合酶可以沿5＇→3＇方向连续合成互补的子链，这条子链称为前导链。
当以另一条母链为模板链时则不能连续合成新链，而是形成许多5＇→3＇方向的不连续片段（称为冈崎片段），当冈崎片段形成以后，由一种DNA聚合酶通过其5＇→3＇外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，并利用后一个冈崎片段作为引物由5＇→3＇合成DNA填补因切下引物形成的缺口，最后由DNA连接酶将冈崎片段连接起来，形成完整的子链，这条子链称为滞后链。简单归纳，DNA在细胞内复制需要DNA模板、合成原料——脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、多种酶、ATP和蛋白质等多种物质参与。其复制的特点是边解旋边复制、半保留复制、半不连续复制。
明确了细胞内DNA的复制过程，下面笔者来对PCR和DNA复制作一下比较。与细胞内DNA复制过程相比，PCR不需要解旋酶、引物酶、DNA连接酶。为什么呢？1.细胞内的解旋酶能在温和条件下利用ATP提供的能量将DNA双链解成单链，而PCR在体外进行，所以使用比较剧烈的条件——加热到90℃ —95℃的方法促使DNA双链打开，因而不需要解旋酶，此过程也不消耗ATP。2.PCR中的引物是人工合成后事先加入PCR仪的，所以不需要引物酶合成RNA引物。3.PCR扩增DNA的原理是DNA双链复制的原理，但过程不同于细胞内DNA的复制过程。既不是边解旋边复制，也不是半不连续复制，而是DNA双链全部解成单链后，引物与DNA单链相应序列互补结合，然后在DNA聚合酶的作用下同时从5＇→3＇方向连续合成两条子链，不存在前导链与滞后链的区别，不存在冈崎片段，当然也就用不着DNA连接酶了。
PCR与细胞内DNA复制相比，都以dNTP（脱氧核苷三磷酸）为原料复制DNA。但不需加入ATP，原因是在DNA聚合酶的催化作用下，引物或者已合成的DNA链的3＇—OH对进入的脱氧核苷三磷酸α—磷原子发生亲核攻击，从而形成3＇，5＇—磷酸二酯键并脱下焦磷酸（PPi）。形成磷酸二酯键所需能量来自α—与β—磷酸基之间高能磷酸键的水解。而真正参与组成DNA的单体化合物为脱氧核苷一磷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）。
最后，利用PCR技术扩增目的DNA，必须要有一段已知目的DNA的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，但不需要知道目的DNA的全部核苷酸序列。PCR扩增的是DNA上两引物结合位点之间的序列，往往是目的DNA上的一个特定片段，而不是整个DNA分子。