沈守国
霍山职业学校，霍山，邮编237200
摘要：烟草青枯病是我国发生的最严重的细菌性病害。拮抗菌对烟草青枯病防治具有一定作用。采用生物法，探究了生物质炭（Biochar）对烟草青枯病拮抗菌田间定殖的影响。以烤烟品种云烟87为研究对象，设置对照重复试验，并在施用后7d、14d、21d对单位体积土壤中拮抗菌的数量、烟草青枯病的发病率以及病情指数进行统计，结果表明，在烟草大田生长的整个周期内，随着生物炭的使用，拮抗菌的数量逐渐增加，烟草青枯病的发病率和病情指数逐渐下降。生物炭对烟草青枯病拮抗菌的田间定殖具有促进作用。
关键词：生物炭；烟草青枯病；拮抗菌；发病率；病情指数
烟草青枯病是我国发生的最严重的,由茄假单胞杆菌引起的一种典型的细菌病害[1]。此病在我国长江以南各烟区发生普遍，尤其以云、贵、川等省发生较为严重[2]。烟草青枯病始盛流行的最适温度为30-35℃，相对湿度90%以上[3]。烟草青枯病属于维管束病害，所有的部位都可受害，最典型的症状是枯萎，病菌多从植株的根部侵入，当叶片首次出现萎蔫时，根部往往不易被觉察，因为此时只有少数根被害，发病初期先是病株一侧有一、二张叶片软化萎垂，但仍为青色，故称青枯病。目前主要通过化学方法，选用化学药剂和氮肥施撒等防治措施来减轻危害。来减轻其危害。但连续使用化学药剂，使得病原菌抗性增加，发病率增高，再次使用化学药剂防治效果不理想，且防治更加困难,对其仍无特效的解决措施[4]。随着绿色生产意识和环保意识的逐步加强，人们对于烟草青枯病的生物防治越来越重视。其中，使用拮抗菌就是生物防治主要方法之一。
拮抗菌能增强烟草植株的抗病性，但将拮抗菌直接施用于大田之后，土壤中的一些微生物对其的竞争，捕食等关系，从而加入了拮抗菌之后，受到各种因素的影响，不适应环境而无法大量繁殖，对致病菌无显著拮抗作用。
生物炭（Biochar）是生物质体在缺少氧气的情况下，经过高温裂解产生的一种具有较高表面积、孔隙度、吸附性和稳定性高的富含碳材料[5]。生物炭内部的疏松多孔折叠结构，具有很大表面积，可以提高土壤蓄水和养分储存能力[6]。生物质碳对于土壤温室气体排放[7]，烟草青枯病拮抗菌的田间定殖具有一定的影响。本研究采用田间小区试验，以单位体积土壤中拮抗菌数量、烟草青枯病的发病率以及病情指数为指标，来测定生物炭对于烟草青枯病拮抗菌的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
烟草青枯病菌由发病烟草植株分离并在实验室保存。添加的拮抗菌为从安徽科技学院创新课题实验室保存菌株根际土壤中分离，并通过筛选得出的生防菌。已经确认有良好的抑制青枯雷尔氏菌的活性。田间试验在凤阳县烟草种植区进行，供试烟草品种为云烟87（感病品种）由凤阳烟草所提供。
1.1.1 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基成分：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15-25g，蒸馏水1000ml，pH=7。将煮好的培养基分装到广口瓶中，放入高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌30min。进行倒平板操作。再将青枯病菌和青枯病拮抗菌分别小心接种在不同培养基上，并配制青枯病菌和青枯病拮抗菌混合悬浊液备用。
1.2 方法
1.2.1 生物炭对烟草青枯病拮抗菌的影响
随机选择一块种植烟草三年以上的健康烟田，划分出5个20㎡的小区，分别标记为A、B、C、D、E进行田间小区试验。其中A作为对照组（CK），B、C、D、E为实验组。
在烟草移栽前，将4Kg生物炭均匀撒在B小区内，每平方米施用200g，A组不进行生物炭处理。然后将5叶期的烟草植株等量移栽到A、B小区中，把实验室培育的拮抗菌按照100g/m2均匀施撒在A、B小区中。分别在移栽后的第7d、14d、21d、28d、35d观察并记录单位面积土壤里拮抗菌的数量。C、D、E进行3次重复试验，并同时记录数据。
采用稀释平板法处理烟草含菌量。分别在移栽后的第7d、14d、21d、28d、35d，采用5点取样法，取土壤表层5～10 cm 处的土样。用分析天平准确称取1 g 土样，加入到盛有 99 mL 无菌水的250ml规格的锥形瓶，同时加入小玻璃珠，摇床振荡 20 min，即制成102 倍的稀释液。 用1 mL无菌移液管，吸取102倍稀释液0.5 mL，移入装有4.5 mL 无菌水的试管中，配制成103 倍稀释液。用同样的方法可制成稀释倍数为104、105、106 的系列稀释菌液。 再进行倒平板操作，然后将接种好的平板培养基放入28～30 ℃的恒温培养箱中培养24～36 h，直至长出菌落为止。统计出的菌落数按下列公式计算，得出每克样品菌数。
每克土壤样品菌数= 某稀释倍数的菌落平均数×稀释倍数
1.2.2生物炭对烟草青枯病发病率、病情指数的影响
随机选择一块种植烟草三年以上的健康烟田，划分出5个20㎡的小区，分别标记为a、b、c、d、e进行田间小区试验。其中a作为对照组，b、c、d、e为实验组。
将处于5叶期、长势相同的健康烟草植株等量移栽到a、b小区中，然后按照10ml/m2的量加入烟草青枯病菌和拮抗菌的混合悬浊液200ml，小心均匀的倾倒于烟草根际土壤附近。再将4Kg生物炭均匀撒在b小区内，每平方米施用200g。A小区不做处理。再在移栽后的第7d、14d、21d、28d、35d时对a、b小区进行烟草青枯病的发病情况调查。c、d、e作为实验组，按照b小区试验步骤进行重复试验。并做好试验数据记录。
1.2.3发病率以及病情指数的调查
青枯病的病情指数按照中国行业标准烟草病害分级及调查方法调查。烟草青枯病的发病率、病情指数和防治效果按下列公式进行计算：
发病率=发病植株/调查植株总数x100%
病情指数=∑[(病情级数x此级株数）/（最高级数x总株数）]x100
1.2.4生物炭对烟草青枯病菌数量和拮抗菌菌量的影响
方法同1.2.2，分别于烟草移栽后第7d、14d、21d、28d、35d调查烟草青枯病菌数量和拮抗菌菌量，调查方法同2.3.1。
2 结果与分析
2.1生物炭对烟草青枯病拮抗菌的影响
烟草植株移栽后，对照组A组小区土壤中拮抗菌的含量缓步上升，第14d达到最高值48x100CFU/ml，然后再逐渐下降。相对于A组，加入了生物炭的B、C、D组小区土壤中拮抗菌的数量在加入后迅速上升，B组在21d拮抗菌的数量达到了最大值146x100CFU/ml。
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表1移栽后不同时间烟草青枯病拮抗菌含量
2.2生物炭对烟草青枯病发病率的影响
烟草移栽后，没有加入生物炭的对照组a小区中烟草的发病率逐渐上升，在35d达到了最大值45.78%。相对于a组，b、c、d在加入了生物炭之后，烟草的发病率首先就控制在较低水平，随着时间的推移，发病率逐步下降，c组在第35d时，发病率达到了最小值10.53%。
表2 移栽后不同时间烟草的发病率情况
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2.3生物炭对烟草青枯病病情指数的影响
烟草移栽后，没有加入生物炭的对照组a小区中烟草的病情指数逐渐上升，在21d达到了最大值42.18%。相对于a组，b、c、d在加入了生物炭之后，烟草的病情指数首先就控制在较低水平，随着时间的推移，病情指数逐步下降，e组在第21d时，病情指数达到了最小值9.6%。
表3 移栽后不同时间烟草青枯病病情指数
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2.4 生物炭对烟草青枯病菌数量和拮抗菌菌量的影响
烟草植株移栽后，对照组a组小区土壤中青枯病菌的数量逐渐上升，在移栽后第28d达到最大值78x100CFU/ml。拮抗菌的含量缓步下降，第35d达到最小值13x100CFU/ml。相对于a组，加入了生物炭的b、c、d组小区土壤中烟草青枯病菌数量逐渐下降，d组在第35d病菌数量达到了最低值28x100CFU/ml。拮抗菌的数量在加入后迅速上升，b组在28d拮抗菌的数量达到了最大值136x100CFU/ml。
表4 生物炭对烟草青枯病菌含量影响
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3 结果与讨论
在烟草的整个生长周期内，设置的对照试验，与未使用生物炭的对照组相比，实验组中拮抗菌的含量较高，青枯病发病率以及病情指数相对较低，生物炭对于拮抗菌的田间定殖，具有一定促进作用。生物炭的孔隙结构可为拮抗菌提供良好的栖息环境，使拮抗菌避免受到其他的影响，此外生物炭可吸附一些对拮抗菌有毒害作用的物质，使拮抗菌的活性增强，从而对于烟草青枯病具有良好的抑制作用。
本试验中研究所使用的拮抗菌与致病菌混合灌根方法是初步尝试，而且实验当时气候条件对于拮抗菌与致病菌的生长并不是最佳气候，所以生物炭对于烟草青枯病拮抗菌的关系还有待进一步研究。
参考文献
[1]王肖田，肖崇刚，邹阳，等.青枯病无致病力菌株对烟草青枯病的控病作用初步研究[J].植物保护，2008,30（2）：79-82.
[2]喻延，李石力，杨亮，丁伟.烟草青枯病防治技术的集成应用.植物医生，2016,29（4）：55-56.
[3]刘宪臣.温湿度对烟草青枯病发生的影响及调控技术研究[D].西南大学，2014.
[4]张永春，黄镇，关国经，等.不同农业生态调控措施对烟草青枯病的影响[J].中国烟草科学，2007,28（4）：49-52.