格日勒其木格
（锡林郭勒盟蒙医医院检验科；内蒙古锡林浩特 026000）
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摘 要：蒙药是蒙医预防、治疗疾病的药类,随着蒙药有效性和安全性评价研究进展，开发利用蒙药资源也成为研究热点。蒙药种类繁多,产地来源多样,经常出现药材混淆和误用的现象。为了规范蒙药在市场中的应用，同时保证蒙药的疗效和质量，需要更加简便、快捷的鉴定方法。近年来蒙药学者在传统鉴别方法基础上结合分子生物学技术鉴别蒙药材,丰富和提高了蒙药鉴定方法和蒙药质量保障，其中聚合酶链式反应片段在高效、准确、可靠等优势在蒙药鉴定研究中被广泛应用，发挥着尤为重要的作用。本文主要对近年来聚合酶链反应技术在蒙药鉴定中应用研究概况和进展进行概述,为蒙药鉴定提供参考依据。
关键词：分子生物鉴定技术；聚合酶链式反应技术；蒙药鉴定；蒙药质量控制；
A:理论与应用研究学术论文（综述报告）
0 引言
蒙药是蒙医预防、治疗疾病的药类,在蒙医药理论指导下进行应用的天然药物及其制品，蒙药有着安全有效、不良反应少、来源丰富等特点，受到人们的广泛重视。随着蒙药有效性和安全性评价研究进展，开发利用蒙药资源也成为研究热点。为了规范蒙药在市场中的应用，同时保证蒙药的疗效和质量，需要更加简便、快捷的鉴定方法。
蒙药鉴定是根据药典，药品标准或地方颁布的药品标准和其他有关典籍的规定，对蒙药的真伪优劣进行严密分析和严格的科学判断[[[]蒙古学百科全书编辑委员会.蒙古学百科全书·医学卷[M].呼和浩特：内蒙古人民出版社，2012.07：165]]。以往蒙药学者对蒙药鉴定基于古籍文献判断，如《识药白晶镜》、《识药学》等著作中根据药品的性状、特点分清了多种药品质量的优劣、较为确切地叙述了蒙药鉴定方法，为蒙药鉴定提供了可靠的经典依据。自20世纪50年代以来，蒙药学学者围绕质量管理和鉴定进行了从表征、显微鉴定、理化鉴定到分子生物鉴定等多方面的探索，逐步完善和丰富。蒙药本草鉴定是根据蒙药古籍文献记载，核对蒙药本草著作对应用植物药材述其分布特点、生长环境、采药季节、形状、药性、药味、功效等知识来鉴定蒙药的来源。性状鉴别是对蒙药形状、大小、颜色、外表特征、性质、味等特征等进行鉴别[[[]吴香杰，包桂花主编.蒙药鉴定学研究思路与方法[M].沈阳：辽宁民族出版社：2019.12:12-13]]。传统的蒙药鉴定方法基础上利用各种新技术，生物鉴定技术进行蒙药鉴定，不仅符合蒙医研究特色同时补充传统鉴定方法的局限性。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术被《中国药典》收录为中药材鉴定方法以来，在中药材真伪药鉴定中广泛应用[[[]张贵君.中药鉴定研究方法学.北京:人民卫生出版社,2010]]。近年来草乌叶、甘草、山沉香、铁线莲、香青兰、西红花、地格达等多种蒙药鉴定研究均利用PCR分子生物学方法鉴定，填补了在蒙药鉴定方面的不足之处，加快了蒙药鉴定方法不断创新。
1.PCR技术
PCR是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术[[[]曹晖，邵鹏柱，毕培曦.中药分子鉴定技术与应用[M].北京：人民卫生出版社，2016：18-40.]]，由美国生物化学家Kary B. Mullis于1983年发明的，他因其发明1993年获得诺贝尔化学奖。其原理是首先加热样品，使DNA变性，或分离成两段单链DNA。然后在“Taq聚合酶”的酶合成两条新DNA链，使用原始链作为模板。这个过程导致了原始DNA的复制，每个新分子都包含一条旧的和一条新的DNA链。然后这些链中的每一条都可以用来创建两个新的副本，以此类推，在有限的DNA情况下能够对其进行扩增，变性和合成新DNA的循环重复30-40次，使原始DNA片段的精确拷贝。
目前，蒙药鉴定始终是蒙药流入市场前最重要的一关，而传统的鉴定方法对蒙药鉴定相关知识要求较高，限制了蒙药鉴定的发展。PCR技术就是对蒙药鉴定相关技术的弥补，其通过对DNA序列的扩增，能够高效快速的鉴别药材的真伪，为蒙药材的鉴别提供了有力的手段。
以PCR为基础的分子生物鉴定技术主要有扩增长度片段多态性（amplified fragment length polymorphism， AFLP）技术、随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术、位点特异性PCR技术、ISSR 技术、mRNA差异显示（mRNA differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR）技术、基因测序和基因芯片等[[[]陈玉容,高炳淼,彭超,等.基于PCR技术的分子标记在南药益智研究中的应用.分子植物育种,2016,14(7):1804-1808]]。
2.PCR鉴定技术在蒙药鉴定中的应用
2.1.RAPD技术
RAPD技术是20世纪90年代研究出的一种DNA多态检测技术[[[]Williams J G K,Kubelik A R,Livak K J,et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research,1990,18(22):6531-6535]]。操作流程是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链，以10个碱基顺序不定的随机引物，在热稳定的Taq酶作用下，进行PCR扩增[[[]李莉,官春云,刘忠松.植物体细胞无性系变异及其突变体的RAPD鉴定分析[J].作物研究,2004(S1):376-379.]]。有研究者用11个引物对个蒙药阿给遗传多样性进行研究[[[]宛涛,蔡萍,张辰波,伊卫东,李方祯,张洪波.内蒙古不同生态地区冷蒿居群遗传多样性的RAPD分析[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2008(02):165-169.]]，表明RAPD技术适用于蒙药植物药材的遗传多样性的分析。RAPD技术在特异DNA序列未知的情况下可检测DNA动态性，可以实现对蒙药生药材的检测，因此蒙药品种鉴定研究方面RAPD技术较其他标记更具有应用前景。
2.2.AFLP技术
AFLP是RFLP与PCR相结合的产物，Vos P等[[[9] Vos P,Hogers R,Bleeker M,et al.AFLP:A new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Research,1995,23(21):4407-4414]]构建和发展的一种DNA分子标记技术。AFLP技术稳定性好、高效率等特点，可利用于蒙药资源分类、品种鉴定、遗传图谱构建方面研究具有良好的应用前进；但此项技术费用较高，对DNA和内切酶的要求高，操作流程长且复杂，尚未见蒙药材鉴定中的应用。
2.3位点特异性PCR技术
位点特异性PCR是一种通过对生物DNA片段进行分析后，用特异性的引物进行PCR扩增，从而达到鉴定目的的一种方法[[[]吴成丽.基于位点特异性PCR技术的贝母药材及藿香正气水中半夏的检测方法研究.成都:成都中医药大学,2016]]。蒙药鉴定中主要是利用蒙药材的某段基因，达到蒙药材真伪鉴别目的，目前在蒙药鉴定研究中最为普遍应用。李谦[[[]李谦,王维宁,过立农,刘杰,郑健,马双成.蒙药材草乌叶DNA条形码研究[J].药物分析杂志,2016,36(06):1044-1052.]]基于对草乌叶9种ITS2序列的变异分析，建立草乌叶的位点特异性PCR鉴别方法。包同力嘎[[[]包同力嘎,图雅,撒切尔,奥·乌力吉,包桂花.基于ITS2序列蒙药甘草DNA分子鉴定研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(A0):177-181.]]等利用位点特异性PCR技术扩增甘草特异性片段，建立对甘草快速鉴别方法。图雅，包桂花等[[[]图雅,木其尔,王秀兰,包桂花.蒙药香青兰DNA条形码分子鉴定研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(61):272-274.]]采用位点特异性PCR技术对蒙药香青兰进行鉴定。陈思有[[[]陈思有,赵容,许亮,冯全君,王冰,康廷国.蒙药并头黄芩的DNA条形码鉴定研究[J].中药材,2016,39(07):1483-1487.]]等采用ITS2序列，从分子水平揭示了蒙药并头黄芩及其近缘关系。表明位点特异性PCR技术在蒙药鉴定与资源开发利用,具有重要的意义。
2.4.ISSR技术
ISSR是利用在植物基因组中常出现的SSR本身设计引物，对位于反向排列的SSR之间的DNA序列进行PCR扩增[[[]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification.Genomics,1994,20(2):176-183]]的标记技术。ISSR技术因其具有多样性、重复性、稳定性高等特点,近些年在蒙药材鉴定和遗传多样性方面得之应用。利用ISSR分子标记技术对内蒙古不同地区蒙药冷蒿的遗传多样性研究[[[]刘越,王真,孙洪波等.蒙药“阿给”不同居群遗传多样性的ISSR分析[J].时珍国医国药,2011,22(08):2009-2011.]，[[]王真,刘越,孙辉等..正交优化设计蒙药阿给ISSR-PCR反应体系[J].安徽农业科学,2010,38(15):7779-7781.]],显示冷蒿具有较高的遗传多样性且不同地区差异明显。
2.5 DDRT-PCR技术
DDRT-PCR是美国Liang P等[[[] Liang P,Pardee A.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction.Science,1992,257(5072):967-971]]创建的mRNA差异显示技术。 是一种比较不同细胞系、不同组织间, 或同一细胞系、同一组织不同条件下基因表达差异的技术方法[[[] 丁常宏,都晓伟,徐莹.DDRT-PCR技术在中药研究中的应用[J].中医药信息,2013,30(03):144-147.]]。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。DDRT-PCR技术假阳性率高、特异性cDNA片段短、扩增倾向高丰度mRNA等不足，在蒙药鉴定及相关研究中的应用例子不多。
2.6基因测序
基因测序是通过高精度的DNA序列分析手段测定蒙药材所需被测的基因片段，并加以对比分析，进而实现对蒙药材的鉴别。张水仙[[[]张水仙.基于蒙药冷蒿基因组低通量测序的SSR遗传多样性分析[D].中央民族大学,2013.]]通过对冷蒿基组进行454低通量测序，从个中获得个可扩增位点己利用边缘设计引物，42对SSR引物对来自不同地区和不同生境的冷蒿材料进行遗传多样性检测，不同生境冷蒿居群的多样性特点，为冷嵩资源的收集、保存和利用奠定了基础。
蒙药动物源药材疗效突出，也是蒙药资源中重要部分，对动物源药材鉴定可利用线粒体细胞色素基因和rRNA基因等[[[]曹晖, 张英.DNA分子标记技术在中药品质与标准化方面的研究概况[J].世界科学技术, 2003, 5 (1) :39.]]。张媛彦[[[]张媛彦. 蒙药肉豆蔻-8散对MIRI大鼠心肌中腺苷酸含量和细胞活性的影响以及不同动物心脏药材的PCR鉴别研究[D].内蒙古医科大学,2018.]]对牦牛、黄牛、家猪、野兔心四种动物心脏药材进行PCR鉴别，发现不同种类动物心脏药材存在差异，为蒙药动物药材分子生物学鉴别提供了参考依据。目前分子生物鉴定技术多数应用在植物药材的鉴定，对动物药材的鉴定尚未开展系统研究，应完善蒙药动物源药材分子鉴定，保障蒙药质量和推广应用。
3 展望
分子生物鉴定技术在蒙药鉴定相关研究取得了一定的进展，利用PCR技术除在蒙药鉴定工作以外还可利用于蒙药作用机制分析、蒙药植物药材生物学研究、蒙药复方作用机制等方面有相当达的发展空间和较多的研究方向。
综上述，PCR技术可以有效地用于蒙药材的鉴定，从而减少蒙药材中掺伪情况的发生，能够清晰揭示蒙药材遗传多样性。在传统的蒙药鉴定基础上，PCR分子生物学鉴定技术具有稳定性高、重复性好、精准的优点，从而为保证蒙药安全、有效、可控提供了有力的技术手段。积极利用分子生物学鉴定技术优势与传统鉴定特色相结合，取长补短，有利于蒙药鉴定理论与实践发展。