巩永霞
新疆阿勒泰地区食品药品检验所，新疆 阿勒泰 836500
摘要：目的：优化食品中副溶血性弧菌的检测方法并对其进行验证。方法：依据国家标准法GB4789.7-20133《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》优化食品中副溶血性弧菌的检测方法，然后对样本进行盲样检测。结果：编号为xj01盲样未检出副溶血性弧菌，编号为xj02盲样检出副溶血性弧菌。结论：本研究优化的食品中副溶血性弧菌的检测方法可以准确检测食品中的副溶血性弧菌。
关键词：食品；副溶血性弧菌；检测方法；优化；验证
副溶血性弧菌为革兰氏阴性杆菌，是一种嗜盐性细菌[1]。含有该菌的食物可导致食物中毒，常见于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品及盐渍食品中，自1951年藤野等报告该菌以来，许多国家相继有病例报道，至今已成为许多沿海国家重要食物中毒重要病原菌之一[2]。随着全球气候变暖的态势加剧，海水盐度下降使得副溶血性弧菌生长的条件得到改善，副溶血性弧菌逐步入侵全球，其引起食中毒及急性肠胃炎已成为全球重要公共卫生问题之一[3]。因此，我国食品安全标准将副溶血性弧菌列为不得检出的病原菌。目前对副溶血性弧菌的检测主要依据国标方法，利用选择培养基，在一定温度条件下培养48-72h，选择可疑菌株进行生化检测。现阶段从组分复杂的食品样品中快速富集分离副溶血性弧菌，开发建立灵敏准确的副溶血性弧菌检测新方法，对食源性疾病的监控和预防具有重要意义。本研究采用细菌培养法，实现快速检测副溶血性弧菌的目的。
1材料与方法
1.1材料
食品中副溶血性弧菌能力认证样品，编号分别为xj01和xj02。
1.2试剂
3% 氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂、3%氯化钠碱性蛋白胨水、TCBS、3%氯化钠三糖铁琼脂、氧化酶试纸、副溶血性弧菌生化鉴定盒。副溶血性弧菌核酸检测试剂盒、细菌基因组DNA快速提取试剂盒。
1.3 实验方法
依据国家标准法GB4789.7-20133《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》的要求进行增菌、分离和鉴定。同时以阳性对照菌进行阳性对照试验[4]。样品开启后，立即加入4 mL的3%氯化钠碱性蛋白胨水进行再水化，待溶解后，吸出放入无菌瓶，再反复用余下的3%氯化钠碱性蛋白胨水清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液。菌株培养的方法为：取保存于-80℃冰箱15%甘油中的菌株，用无菌接种环在LB固体培养基上进行接种划线。副溶血性弧菌使用含3% NaCl的高盐培养基，其余菌株使用含0.5% NaCl的普通培养基。
培养18-24 h后，挑选单克隆菌落于LB液体培养基中，于细菌恒温培养摇床中37℃180 rpm培养至对数生长期，收获菌液。采用平板计数法对菌液进行菌落计数，随后向剩余的菌液中加入终浓度为1%的甲醛溶液，4℃作用24h灭活，并采用培养法验证细菌是否灭活完全。将灭活的菌液用无菌生理盐水以4℃ 4000rpm离心15分钟洗涤三次，得到的菌液置于4℃冰箱中保存备用。然后将上述样品原液于36 ℃培养18h完成增菌过程。在初步鉴定时取纯培养物进行氧化酶试验、涂片镜检及转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层。最后使用取纯培养物用全自动细菌鉴定，同时进行生化鉴定实验。
2 结果
按照GB4789.7-2013《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》进行鉴定后，样品xj02和阳性对照菌反应结果均一致，为检出副溶血性弧菌。样品xj01从第一步增菌培养18 h，增菌液澄清，取增菌液划TCBS平板，弧菌显色培养基平板，平板上也无菌落生长，即判定未检出副溶血性弧菌。
3 讨论
建立快速灵敏的食源性致病菌检测方法对于临床医学诊断及食品安全等均具有十分重要的意义。传统的基于分离培养和生化鉴定法检测食源性致病菌，一般都比较耗时费力，且灵敏度不高。因此建立科学合理、快速准确的食源性致病菌检测新方法现已成为公共卫生检测领域的研究热点问题之一[6]。在副溶血性弧菌检测中，平板分离培养的时候，该目标菌在弧菌显色培养基明显TCBS琼脂长得快，菌落特征更明显，因此，我们实验室更偏向于在弧菌显色培养基上挑取可疑菌落进行下一步鉴定，以提高检验效率及准确率。实验室要做好能力验证，必须控制好检测过程的每一个步骤，这样才能保证检验结果准确有效[6]。首先要对实验室日常使用检测工作中所使用的培养基、试剂、阳性对照、对照培养基和生化试剂进行监控，尽量采用选择性培养基，仪器也要定期进行质量监控。实验无菌操作过程，避免操作人员和环境中带来的微生物污染，以及样品相互间的交叉污染。在检验中目标菌在不同平板上的菌落特征，也需要检测者有丰富的检测经验，多挑菌落进行鉴定，防止漏检现象的发生，才能有效地鉴定目标菌。本次实验室能力验证均取得满意结果，本法适用于组分复杂的样本，且对于副溶血性弧菌含量低的样本检测也有效，对于扩大副溶血性弧菌的检测范围和检测效率具有重要的知指导价值。
参考文献
[1]胡元庆, 黄玉萍, 李凤霞,等. 水产品中副溶血性弧菌LAMP检测方法的优化[J]. 现代食品科技, 2017(06):313-320.
[2]杨穗珊, 谢作蓉, 林宝英. 食品中副溶血性弧菌检测能力验证分析[J]. 现代食品, 2018, 000(011):P.91-93.
[3] 陈伟鑫, 郑磊, 吴杰,等. 提高食品中副溶血性弧菌检出率的方法探讨[J]. 中国卫生检验杂志, 2011(07):1718-1719.
[4] 刘娜, 骆海朋, 陈怡文,等. 食品中副溶血性弧菌检验能力验证样品的研制及其应用[J]. 食品安全质量检测学报, 2019, 010(007):1816-1820.
[5] 郭丹凤. 水产品中耐药性致病副溶血性弧菌的预测模型建立[D]. 上海海洋大学, 2014.
[6] 魏春豪, 迟海, 杨光昕. 食源性副溶血性弧菌的检测方法研究进展[J]. 食品与发酵科技, 2020, v.56;No.215(01):88-96.