张静
黑龙江省大兴安岭地区食品药品检验检测所 药品室 165000
【摘要】目的：就返魂草的分析鉴别研究进行分析报告。方法：采集某地区返魂草，通过脱水干燥处理后，进行药材的预处理、高盐低pH值法处理、PCR扩增、DNA测序、序列拼接等步骤进行返魂草中DNA的提取与测定。结果：本研究15份样品中单麻叶千里光6份，麻叶千里光9份。PCR扩增后产物电泳显示呈较亮条带，总DNA提取质量较好。DNA测序结果显示，单麻叶千里光与麻叶千里光见得遗传距离为0.1285，存在一定的种内遗传距离。结论：通过返魂草的总DNA提取与测序，能够有效为不同种类的返魂草鉴别工作提供参考。
【关键词】返魂草；麻叶千里光；单麻叶千里光；DNA提取；鉴别
返魂草（Senecionis Cannabifolii Herba，SCH）为菊科植物，地上干燥部分入药，我国返魂草主要分布于河北、黑龙江、吉林、内蒙古等地。目前已知的返魂草种类有两种，即单叶返魂草及宽叶返魂草[1]，本药性凉、味苦，具有较好的利湿解毒、清洁明目、散瘀止痛、平喘止咳等效果，在疾病诊疗中的应用较为广泛，如皮肤湿疹、急慢性炎症、痈肿疮毒、泄泻痢疾、急性扁桃体炎等[2-3]，药学领域将返魂草单味药材制成制剂[4]，应用于部分急慢性病变的治疗，获得了较为满意的效果，且安全性较高。返魂草的活性成分主要有黄酮类、多糖类、酚酸类等，不同成分的效用各不相同[5]。本研究主要就黑龙江地区的返魂草进行调查分析，采集部分药用叶片，实施了DNA分析，为返魂草的实际应用提出部分思路。
1 研究材料
于黑龙江地区进行返魂草的采集，置入硅胶袋内保存，并尽快送入实验室利用电热恒温干燥箱进行脱水干燥处理，制备待测样品。
1.2、DNA的提取与测定
并由专业的检验人员通过植物DNA提取试剂盒进行样品中总DNA的提取，并进行提取总DNA的测定与分析，具体方法如下：
将待测样品进行预处理，取100mg加入10% PVP-40 粉末，速加液氮进行研磨，获得粉末状样品，并置入预冷离心管内，加入600μL提取缓冲液，振荡均匀后，置入数显式电热恒温水浴锅内，65℃处理1~1.5h左右，4℃条件下离心处理10min，留置上清液，并加入2/3的2.5mol/L的KAc，混合均匀，置入零度冰箱内静置30min，再次离心，取上清液加入等量-20℃的预冷异丙醇。室温下静置30min，再离心20min，并用70％乙醇反复洗涤沉淀两次，沉淀物置于超净工作台风干，再采用100μL灭菌水定容[6]，置入-20℃的冰箱内冷冻保存。在此基础上，经由PCR扩增、DNA测序、序列拼接等流程，明确样品中DNA条形码序列[7]，其中PCR扩增程序中，变性温度控制在92~95℃左右，时间为30~60s，若G-C序列较多者，可进行适当的调节，但需要严格控制变性温度与时间，避免对酶活性造成影响。
退火温度为50~65℃，时间为25~180s，延伸温度为72℃，需要严格控制时间，表明非特异性产物的增加。DNA测序则采用双脱氧末端终止法处理。并就结果进行计算分析处理。
2 结果
2.1、DNA材料分析：本研究共采集15份样品，均为返魂草，其中单麻叶千里光（Senecio cannabifolius var. integrifolius）6份，麻叶千里光（Senecio cannabifolius Less.）9份。
2.2、待测样品处理结果分析：本研究中15份样品，进行总DNA提取后，进行了PCR扩增处理，扩增后产物电泳显示呈较亮条带，表明总DNA提取质量较好。DNA测序结果显示，单麻叶千里光与麻叶千里光间的遗传距离为0.1285，存在一定的种内遗传距离。
3 讨论
返魂草主要于我国东北部、河北等地区分布，主要于湿草甸、山沟林缘上生长，本药始载于《新华本草纲要》[8]，具有较好的止痛化瘀、止血解毒等效果。在抗炎、抗菌、免疫调节、止咳祛痰、镇痛等方面发挥着重要作用[9-10]。本研究主要就单麻叶千里光、麻叶千里光这两类返魂草进行了分析鉴别，结果显示，扩增后产物电泳显示呈较亮条带，总DNA提取效果较为满意。DNA测序结果示，单麻叶千里光与麻叶千里光间的遗传距离为0.1285，有研究进行了林荫千里光与返魂草种间遗传距离的测定，结果示遗传距离为0.1735，要高于种内遗传距离[11]。
综上所述，单麻叶千里光与麻叶千里光为主要的返魂草类型，两者在形态上具有较为显著的区别，同时存在一定的种内遗传距离。在今后的工作中，须重视形态分类鉴别与分子分类鉴别的联合应用，以更好的开发利用返魂草。
参考文献
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