王洋 刘海
菏泽医学专科学校 274000
【摘要】目的 探讨角鲨烯长期服用的安全性研究。方法 采用限量法的雌、雄性大鼠急性经口毒性试验，细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验，90天经口毒性试验。结果 采用限量法，在本试验条件下角鲨烯雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于10.0g/kg·bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳w类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；角鲨烯以0.83g/kg·bw、1.67g/kg·bw、3.33g/kg·bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。结论 角鲨烯长期服用具有安全性。
关键词：角鲨烯；大鼠；长期毒性
角鲨烯系从生活在海洋深处1000m的大型鲨鱼(如鲸鲨、姥鲨等) 肝脏中提取而得, 是一种几乎无色的油状液体, 其化学结构类似β-胡萝卜素异戊间二烯化合物, 它是由2、6、10、15、19、23-六甲基-2、6、10、14、18、22-二十四碳六烯构成的不饱和烃。[1]经研究表明，角鲨烯具有抗衰老、抗疲劳、抗三高、抗癌作用。[2]本文旨在研究角鲨烯的食用安全性。
1试验材料
1.1试验药物 角鲨烯，含量99%，人体推荐剂量为2.0g/人/d。
1.2实验动物 SPF级健康离乳SD大鼠，雌雄各半，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供；清洁级ICR小鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。
2 试验方法
2.1急性经口毒性试验：采用限量法，选用体重为180-220g的SPF级健康离乳SD大鼠20只，雌雄各半。以12mL/kg·bw一次灌胃，急性经口毒性剂量为10.0g/kg·bw。给样后连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。期间每周称量一次体重。
2.2 细菌回复突变试验：按GB 15193.4—2014 食品安全国家标准 细菌回复突变试验要求，采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五株菌株进行试验。首次试验采用平板掺入法、证实试验采用预培养平板掺入法。采用β-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝S9作为体外代谢活化系统。首次试验剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性突变剂对照，通过首次试验确定受试物的溶解度与细菌毒性。根据首次试验结果设定证实试验的剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿。样品置于0.103Mpa条件下高温灭菌20min，在无菌条件下，称量受试样品并配制成溶液，受试样品用无菌水配制成50mg/mL，即高剂量组，用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成15、5、1.5、0.5mg/mL4个剂量组。
2.3 哺乳动物红细胞微核试验：按GB 15193.5—2014 食品安全国家标准 哺乳动物红细胞微核试验要求，选用体重25～35 g ICR种小鼠50只，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为5个组，每组10只，雌雄各半。受试样品按人体推荐剂量的25、50、100倍即0.83、1.67和3.33g/kg·BW给予，同时设溶剂对照组，40mg/kg·bw环磷酰胺为阳性对照组，采用30h给受试物法两次给受试样品间隔24h，第二次给受试样品后6小时处死动物，取胸骨常规制片、镜检。每鼠计数2000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计。每鼠计数200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数（NCE），并计算嗜多染红细胞与总红细胞比值（PCE/RBC）。
2.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验：按GB 15193.23—2014 食品安全国家标准 体外哺乳类细胞染色体畸变试验要求，选用中国仓鼠肺（CHL）细胞株。据细胞毒性和受试样品溶解情况，选择5000、2500、1250μg/mL3个剂量组进行染色体畸变试验。在无代谢活化条件下，采用直接致突变物丝裂霉素做为阳性对照物，浓度为0.25μg/mL；在有代谢活化条件下，采用间接致突变物环磷酰胺做为阳性对照物，浓度为20μg/mL。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿中，放CO2培养箱内培养。试验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9mix（不加S9mix时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3h。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用PBS溶液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱,于24 h收获细胞。于收获前4h，加入细胞分裂中期阻断剂秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL。
收获的细胞经消化、低渗、固定后滴片、染色以备阅片。在油镜下阅片，每一个剂量组应分析不少于100个分散良好的中期分裂相。
2.4 90天经口毒性试验：按GB 15193.13—2015 食品安全国家标准90天经口毒性试验要求，选用体重80±5gSPF级健康离乳SD大鼠80只，雌雄各半，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为4个组，每组10只，雌雄各半。受试样品按人体推荐剂量的25、50、100倍即0.83、1.67和3.33g/kg·BW给予，同时设溶剂对照组，每日经口灌胃一次，连续90d。每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量。 计算动物增重、摄食量、食物利用率等，在试验前和试验结束时，至少对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。若发现高剂量组动物有眼部变化，则应对所有动物进行检查。 测定血常规、生化等血液学指标。大鼠在试验结束时进行尿液常规检查，实验结束将动物处死并进行大体解剖，肉眼观察有无异常，称量并计算脏体比值，进行主要组织病理学检查。
1.5 数据处理 采用SPSS11.0统计软件对数据分别进行One-way ANOVA分析及Dunnett检验，检验水准α=0.05。
2结果
2.1 大鼠急性经口毒性试验：在14d观察期内，雌、雄大鼠外观均正常，四肢活动正常，无死亡。剖检未出现肉眼可见病变。获得雌雄大鼠角鲨烯急性经口毒性试验LD50＞10.0g/kg·bw。根据急性毒性分级标准，将其判定为无毒级物质。
2.2 细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果：角鲨烯在加与不加S9情况下，细菌回复突变试验结果均为阴性；哺乳动物红细胞微核试验结果为阴性；体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果为阴性。
2.3 90天经口毒性试验：
2.3.1 一般情况观察 各组动物生长发育、活动均正常，大鼠毛发光润，摄食、饮水、粪便均正常。无中毒表现和死亡。
2.3.2 对大鼠体重、增重及食物利用率的影响 以0.83g/kg·bw、1.67g/kg·bw 和3.33g/kg·bw 三个剂量的角鲨烯经灌胃给予大鼠，连续90天。与阴性对照组相比，各剂量组动物每周体重、体重增加量、进食量和食物利用率均无统计学差异（P>0.05）。90天喂养结束时，与阴性对照组相比各剂量组动物总体重增加量、总进食量和总食物利用率均无统计学差异（P>0.05）。
2.3.3眼部检查 在试验前和试验结束时，对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。未发现高剂量组和对照组动物有眼部异常变化。
2.3.4大鼠尿常规指标 经口给予大鼠不同剂量的角鲨烯90天，测定大鼠尿常规指标。结果各剂量组尿常规指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。
2.3.5 大鼠血液学指标 经口给予大鼠不同剂量的角鲨烯90天，测定各剂量组大鼠血液红细胞计数、血红蛋白水平、白细胞计数及其分类等指标、红细胞压积、血小板计数等指标。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。
2.3.6 大鼠血液生化指标 经口给予大鼠不同剂量的角鲨烯90天，测定各剂量组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、氯、钾、钠的水平。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。
2.5.7 大体病理及组织学检查 经口给予大鼠不同剂量的角鲨烯90天，测定各组大鼠心脏、胸腺、肾上腺、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸、卵巢绝对重量及相对重量（脏/体）。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组雌雄大鼠大体解剖观察均未见异常改变。大体解剖观察未发现与受试样品有关的组织病理学改变。
3结论
本研究针对角鲨烯长期食用安全性进行了研究，采用限量法，在本试验条件下角鲨烯雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于10.0g/kg·bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；角鲨烯以0.83g/kg·bw、1.67g/kg·bw、3.33g/kg·bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。为角鲨烯应用于保健食品原料安全性提供了依据。
参考文献
[1] 潘风.角鲨烯提高人类生命质量的奥秘[M].上海医药,2002,23(1):30-31.
[2] 赵炎成.八宝合一-角鲨烯的食疗保健功能[J].东方食疗与保健,2006,11: 6～7.