石继伟
镇江市食品药品监督检验中心，镇江 212000
【摘要】 目的：建立六轴子中闹羊花毒素Ⅱ和闹羊花毒素Ⅲ的高效液相色谱蒸发光散射器（HPLC-ELSD）测定方法。方法：以C18色谱柱为固定相，以水-甲醇为流动相，梯度洗脱，流速为1.0mL/min，蒸发光散射器检测。结果：闹羊花毒素Ⅱ在0.992～14.887μg，闹羊花毒素Ⅲ在1.021～15.315μg，进样量对数和峰面积的对数之间线性关系良好。两者的平均加样回收率分别为97.73%和98.52%；测得7批六轴子药材中两者含量分别为0.83～1.56mg/g和0.83～2.61mg/g。结论：所建立的含量测定方法简便、快速，可用于六轴子中闹羊花毒素Ⅱ和闹羊花毒素Ⅲ的含量测定。
六轴子为杜鹃花科植物羊踟蹰 (Rhododendron molle（BI.）G. Don)的干燥成熟果实。有祛风止痛，散瘀消肿之功效，可用于跌扑损伤，风寒湿痹[1]。因其有较强的毒性，有许多因误食而中毒甚至死亡的报道[2]。作为一种有毒的中药材，目前关于六轴子的化学成分含量的研究相对较少[4]。近年来文献以及课题研究表明，六轴子中的二萜类成分既是其主要有效成分，也是其毒性的来源[3]。闹羊花毒素Ⅱ(Rhodojaponin-Ⅱ)和闹羊花毒素Ⅲ(Rhodojaponin-Ⅲ)是其最常见的二种二萜类成分。因此本研究旨在建立闹羊花毒素Ⅱ和闹羊花毒素Ⅲ的高效液相色谱蒸发光散射检测含量的测定方法，为其质量控制提供参考。
1 实验材料
1.1 药材和试剂 7批六轴子药材购自各地药材市场，闹羊花毒素Ⅱ对照品（批号：111983-201601）和闹羊花毒素Ⅲ对照品（批号：111984-201601）购自中国食品药品检定研究院。甲醇、甲酸为色谱纯，购自国药集团。
1.2主要仪器 LC-2030C高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司），BP211D电子分析天平（德国Satorius公司）。
2 方法和结果
2.1 对照品溶液的制备 精密称取闹羊花毒素Ⅱ和闹羊花毒素Ⅲ对照品各约10mg，置20ml容量瓶中，以80%甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，制得约0.50mg/ml的闹羊花毒素Ⅱ和闹羊花毒素Ⅲ的混合溶液。
2.2 供试品溶液的制备 取六轴子药材，超离心研磨，精密称取粉末约1g，置锥形瓶中，精密加入80%甲醇50ml，称重，加热回流提取2h，放冷，用80%甲醇补足减失的重量，离心10min，精密量取上清液25ml，回收溶剂至干，残渣加80%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液为供试品溶液。
2.3 色谱条件 采用OMNI Zinger C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；柱温30℃，进样量20μL。以甲醇为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，流速1.0ml/min，梯度洗脱程序：0～26min，30%A→50%A，70%B→50%B。蒸发光散射检测器参数：漂移管温度40℃，载气压力326KPa，增益6。在该色谱条件下，闹羊花毒素Ⅱ和闹羊花毒素Ⅲ的响应度良好，且与其他组分的色谱峰分离完全。色谱图见图1和图2。
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2.4 线线关系考察 取对照品溶液2、5、10、15、20、30μL，按照“2.3”项下色谱条件进行分析，记录色谱峰面积。以峰面积的对数为纵坐标（Y），进样量的对数为横坐标（X），进行线性回归，绘制标准曲线。得到闹羊花毒素Ⅱ的回归方程为：Y = 1.622X+ 6.640，R2=0.999，闹羊花毒素Ⅲ的回归方程为：Y = 1.648X+ 6.652，R2=0.998。结果表明，两者在范围内线性关系良好。
2.5 检测限及定量限测定 精取对照品溶液适量，以80%甲醇稀释，进行检测。信噪比为10:1的时候，测得定量限；信噪比为3:1的时候，测得检测限。两者的定量限分别为0.992μg和1.021μg，检测限分别为0.331μg和0.255μg。
2.6 精密度实验 取对照品溶液，于1天内重复进样5次，计算RSD作为日内精密度，两者的RSD值分别为1.3%和1.5%。取对照品溶液，连续进样3天，每天进样2次，计算RSD作为日间精密度。两者的RSD值分别为1.6%和2.0%。
2.7重复性实验 精密称取3号样品粉末约1g，按“2.2”项下的方法平行制备6份溶液，按“2.3”项下的色谱条件进样，计算两者的RSD分别为1.7%和1.0%，说明其重复性良好。
2.8 加样回收实验 精密称取1号药材粉末约0.5g，平行6份，分别加入两种对照品适量，按“2.2”项下的方法制备溶液，按“2.3”项下测定峰面积，带入标准曲线计算两者的回收率。结果显示，闹羊花毒素Ⅱ的平均加样回收率为99.18%，RSD为2.2%；闹羊花毒素Ⅲ的平均加样回收率为98.68%，RSD为1.5%。
2.9 样品含量测定 取已收集的7批六轴子样品，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件测定峰面积，计算各份样品的羊花毒素Ⅱ和闹羊花毒素Ⅲ的含量。结果见下表。
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3 讨论
六轴子多为野生资源，不同产地、批次的六轴子中闹羊花毒素Ⅱ和闹羊花毒素Ⅲ的含量差异较大。在本研究中，4号样品闹羊花毒素Ⅱ的含量是6号样品的1.8倍；3号样品的闹羊花毒素Ⅲ的含量是2号样品的3.1倍。我们在临床应用时，需考虑不同产地和批次六轴子药材之间的差异，同时也应建立六轴子药材的质量控制标准。
参考文献
[1] 江苏省药品监督管理局.江苏省中药饮片炮制规范.[S].2002年版.江苏：江苏科学技术出版社，2002:316.
［2］赵华云，王文会，罗子幸，等．大剂量中药羊踯躅根致急性中毒1例［J］．中国医院药学杂志，2007，27( 1) : 134-135．
［3］张小红，董磊迟，李会军，等．高效液相色谱蒸发光散射检测法测定闹羊花中闹羊花毒素Ⅱ的含量［J］．中国新药杂志，2013，22( 5) : 602-604．