刘畅1，王冰梅1，王晓燕1，陶冶2，应达时1,3，郑彦臣1*
（1长春中医药大学，长春 130117；2长春中医药大学附属医院，长春 130021；3吉林农业科技学院，吉林 132101）
摘要：目的 研究黄芩苷对肺腺癌细胞增殖和自我更新能力的影响。方法 使用0、50、100 nM黄芩苷处理H1299细胞，采用CCK8法检测细胞增殖活性；集落形成实验检测细胞的自我更新能力。结果 黄芩苷使H1299细胞活性明显降低（P<0.005）；集落形成实验中集落数量显著减少。结论 黄芩苷对H1299细胞的增殖和自我更新能力产生抑制作用。
关键词：黄芩苷；肺腺癌；增殖；集落形成
世界卫生组织国际癌症研究署（IARC）2018年发布报告指出，肺癌是发病率和死亡率位居首位的恶性肿瘤疾病[1]。属于非小细胞肺癌的肺腺癌预防和早期诊断较困难，且在治疗过程中副作用严重并易产生耐药性，严重威胁人类健康。因此，明确肺癌的发病机制，寻找抑制肿瘤细胞增殖和转移等生理过程的方法是治疗肺癌的首要任务。黄酮类化合物属于天然分子，具有广泛的抗癌作用，自古以来就存在于人类的食品和饮料中，比合成药物的副作用小，因此可作为一种潜在的抗癌化合物，为进一步开发新型的癌症治疗剂奠定基础[2]。黄芩苷化学式C21H18O11，是唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的有效成分之一，已在抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌等多个治疗领域广泛应用[3]。研究表明，黄芩苷可通过诱导细胞凋亡、触发自噬、抑制12-脂氧合酶（12-LOX）和抑制转移过程对肝癌、胰腺癌等多种实体肿瘤有抑制作用[4]。本实验选用H1299肺腺癌细胞系，分析黄芩苷是否对肺腺癌细胞的增殖和自我更新具有调节作用。
1材料
1.1细胞 人肺腺癌H1299细胞，由中国北京协和细胞库提供。
1.2试剂 黄芩苷（纯度≥98%）购于北京索莱宝公司；CCK8试剂盒购于上海碧云天公司；胎牛血清、DMSO、RPMI-1640培养基、双抗均购于美国Gibco公司；胰蛋白酶、谷氨酰胺、非必需氨基酸均购于美国Sigma公司；结晶紫、多聚甲醛购于南京化学试剂公司。
1.3仪器 Multiskan GO酶标仪，Micro21R低温离心机，HERA Cell150i二氧化碳培养箱，美国Thermo Fisher公司；DM3000倒置荧光显微镜，德国莱卡公司；MDF-U4186S超低温冰箱，日本三洋公司；SX-500高压灭菌锅，日本TOMY公司。
2方法
2.1细胞培养 使用1640完全培养基，添加1 %双抗，1 %谷氨酰胺以及1 %非必需氨基酸，用于肺腺癌细胞H1299的体外培养。
2.2药品配制 黄芩苷用DMSO溶解，制备成100 mM储液，分装后置于-20℃长期储存，使用时用培养液稀释至相应浓度。
2.3细胞增殖活性检测 96孔板每孔加入5×104个细胞，待细胞贴壁且状态良好时分别加入0、50、100 μM黄芩苷处理，并继续培养。24 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液，在37°C 5 % CO2的培养箱中观察颜色变化，孵育4 h后，450 nm波长下检测OD值。
2.4细胞集落形成实验 细胞在正常条件下培养，用胰蛋白酶消化成单个细胞，然后在6 cm培养皿中接种500个细胞，十字交叉法摇晃均匀，保证接种的后是单个细胞，待细胞贴壁后添加不同浓度的黄芩苷，继续培养细胞14 d，检测到集落形成且大小密度适宜时，用4 %多聚甲醛固定细胞，洗涤，加入结晶紫溶液，洗去多余染料后观察黄芩苷处理组产生的集落大小和数量。
2.5统计方法 实验数据分析使用Graphpad 7.0软件完成。采用t检验对各实验数据比较分析，以均数±标准差表示结果，各实验至少重复三次，P<0.05时有统计学意义。
3结果
3.1黄芩苷处理对肺腺癌细胞增殖能力的影响 CCK8结果表明，50 nM和100 nM黄芩苷处理能够显著降低H1299细胞活力。说明黄芩苷处理能够显著抑制肺腺癌细胞H1299的增殖能力。见图1。
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图1 不同浓度黄芩苷处理对H1299细胞增殖能力的影响（***P<0.005）
3.2黄芩苷处理对肺腺癌细胞自我更新能力的影响 细胞集落形成实验表明，100 nM黄芩苷处理组中无较大的集落形成，对照组可观察到100个左右的细胞集落。结果表明黄芩苷可对H1299细胞的集落形成和自我更新能力产生有效地抑制作用。见图2。
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图2 不同浓度黄芩苷对H1299细胞自我更新能力的影响
4讨论
黄芩苷具有多种药理学活性，其抗癌活性在近年来许多研究中被证实。Yang等人发现，黄芩苷可以抑制结直肠癌细胞活力、细胞周期、细胞的迁移和侵袭以及诱导细胞凋亡来发挥其抗癌作用[5]。Duan等研究表明，黄芩苷可以通过调节miRNA-338-3p及其靶基因MORC4在细胞中的表达来抑制乳腺癌细胞[6]。近期的一项研究表明，黄芩苷在抑制间皮瘤细胞生长、迁移和侵袭的同时，通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞凋亡并提高细胞对化疗药物的敏感性，提示黄芩苷可能是一种有效的间皮瘤治疗药物[7]。但黄芩苷能否对肺腺癌产生抑制作用尚不明确，因此本研究验证了黄芩苷的此项药理作用。
使用CCK8快速高灵敏度试剂盒检测H1299肺腺癌细胞增殖活力，结果表明50 nM和100 nM黄芩苷处理可以显著抑制H1299细胞增殖。科学研究发现，在许多癌症实体瘤中都分离出了具有干细胞特性的细胞亚群，肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力[8,9]，通过抑制癌细胞的自我更新能力，从而防止其进一步扩散。通过集落形成实验观察黄芩苷对肿瘤细胞自我更新能力的影响，结果表明未用黄芩苷处理可以观察到形成约100个集落，50 nM黄芩苷处理后只观察到3个集落，100 nM黄芩苷处理后未看到有集落形成。说明在黄芩苷的作用下H1299细胞集落形成能力显著下降，黄芩苷可以有效抑制肿瘤细胞的自我更新能力。
黄芩苷对肺腺癌细胞有很好的作用效果和应用前景，目前还没有针对黄芩苷的临床试验，缺乏关于其在人体中的安全性和有效性的证据。未来的研究中可以通过开展更多的临床试验来研究黄芩苷在癌症中的作用，将其更好地应用于癌症医学。
参考文献
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[3]Li-Weber M. New therapeutic aspects of flavones: the anticancer properties of Scutellaria and its main active constituents Wogonin, Baicalein and Baicalin. Cancer Treat Rev, 2009, 35(1): 57-68.
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[6]Duan X, Gao G H, Pei X H, et al. Baicalin Inhibits Cell Viability, Migration and Invasion in Breast Cancer by Regulating miR-338-3p and MORC4. Onco Targets Ther, 2019, 12: 11183-11193.
[7]Xu W F, Liu F, Ma Y C, et al. Baicalin Regulates Proliferation, Apoptosis, Migration, and Invasion in Mesothelioma. Med Sci Monit, 2019, 25: 8172-8180.
[8]Tirosh I, Venteicher A S, Hebert C, et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature, 2016, 539(7628): 309–313.
[9]Fang L, Zhu Q H, Neuenschwander M, et al. A Small-Molecule Antagonist of the Catenin/TCF4 Interaction Blocks the Self-Renewal of Cancer Stem Cells and Suppresses Tumorigenesis. Cancer Research, 2015, 76(4): 891–901.
基金资助：吉林省中医药管理局中医药科技项目（No.2020162）。
第一作者：刘畅，讲师，主要从事天然小分子活性研究，Email：81007670@qq.com。长春中医药大学临床医学院，吉林省长春市博硕路1035号，邮编：130117。
通讯作者：*郑彦臣，副教授，主要从事中医药实验研究，E-mail：674496847@qq.com。长春中医药大学临床医学院，吉林省长春市博硕路1035号，邮编：130117。