杨军 段勇军
甘孜州疾病预防控制中心 四川甘孜州 626000
【摘要】目的 分析四川省石渠县鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌差异区段分型（DFR）。方法 对分离自石渠县鼠疫疫区的58株鼠疫菌,应用23个DFR和PMT1的扩增引物，进行PCR扩增分型，确定鼠疫菌DFR基因型。结果 鼠疫菌DFR分型分为3型，暨G14型56株，G43型1株和G05型1株。结论 四川省石渠县鼠疫菌主要DFR型别未发生变化，这也是动物鼠疫持续流行的原因。
【关键词】鼠疫；石渠县；基因分型；DFR
随着基因技术的发展，应用分子分型技术对鼠疫耶尔森菌是鼠疫的病原体（以下简称鼠疫菌）分型变得日益成熟，鼠疫菌属于基因组单细菌，应用DFR分型技术显得很成熟。杨晓燕等将青海省鼠疫菌分为11个基因型[1]，安翠红等将陕西省鼠疫菌分为3个基因型[2]和朱俊杰等将云南省171株鼠疫菌分为7个基因型等[3]。我省也发现了2类6块鼠疫自然疫源地[4]。为分析石渠县鼠疫自然疫源地鼠疫菌基因分型，开展鼠疫菌DFR基因分型实验，结果报告如下。
1材料与方法
1.1实验菌株 选择1997—2016年四川石渠县鼠疫疫源地具有代表性的58株鼠疫菌。
1.2鼠疫菌培养及核酸提取 将鼠疫菌接种于血平板上，28℃培养24小时，按照Wizard Genomic DNA Purifcation Kit核酸提取试剂盒的操作规程在中国疾病预防控制中心传染病所P3实验室中提取鼠疫菌核酸。
1.3 试剂及仪器耗材
1.3.1试剂：超纯水；Taq Mix（2×）；核酸染料；TBE电泳缓冲液；琼脂糖； DNA Marker (100bp Plus DNA Ladder Marker)。
1.3.2仪器和耗材：电泳槽、水平电泳仪、PCR扩增仪、凝胶成像仪，移液器及其枪头，1.5mlEP管，0.2mlPCR反应管，以及离心机。
1.4 引物和PCR扩增方法 使用的23个DFR和PMT1的扩增引物，由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，按照引物检测报告说明使用。PCR反应体系25μl：超纯水7.5μl，2×PCR Supermix 12.5μl，上下游引物各1μl，模板1μl。PCR扩增条件：:95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸5min。其中DFR18和DFR19的退火温度为56℃，其他条件不变，同时用EV76菌株作为阳性对照。PCR扩增产物取5微升并用goldview染色后，经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪下读取结果，未出现条带者判为“－”，出现条带者判为“＋”。
2结果
2.1 实验结果 查询DFR基因库[5]，石渠县菌株分三型，其中G14（DFR06、DFR11、DFR12、DFR13、DFR18、DFR19 、DFR20和DFR23缺失）型56株，G43型（G14型缺失DFR04演变而来）1株，G05型（DFR01、DFR02、DFR13和DFR23缺失）1株（1999年石渠人间鼠疫）见表1，表2。
.png)
注：表头中01-23代表DFR01-DFR23位点，“1”表示基因组中存在该DFR；“0”表示该DFR在基因组中缺失。
Note:“1”means PCR amplification showed positive. “0”means PCR amplification showed negative.
表2 四川省鼠疫菌DFR分型与生态型对比
Tab.2 Compare of DFR-genotype and Biochemical type for Y. pestis Strains in Sichuan Province
.png)
3讨论
按照DFR基因库，石渠县鼠疫菌DFR分型分为3型，暨G14，G43和G05型。G43型只有1株，是G14型缺失DFR04而来，说明该地鼠疫菌株已经发生了微进化，但是主要流行菌株未发生改变，也是该疫源地一直存在动物鼠疫的原因之一。石渠县青海田鼠鼠疫自然疫源地的菌株分为G14和G43，并且以G14型为主，而与四川省石渠县接壤的青海省称多县珍秦乡，该地田鼠型菌株DFR分型为G14型，可以确定二者同属青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地。
参考文献
[1]杨晓艳,魏柏青,辛有全,等.青海高原鼠疫菌DFR分型及空间分布特征的研究[J].中国人兽共患病学报,2014,30(4):387-389.
[2]安翠红,陈宝宝,吕文,等.陕西省鼠疫耶尔森菌差异区段分型及其流行病学特征分析[J].中国人兽共患病学报,2017,33(10):916-919.
[3]朱俊杰,王鹏,李伟,等.云南省鼠疫菌株差异片段基因分型及其流行病学特征[J].中华地方病学杂志,2013,32(6):599-601.
[4]梁莹,汪立茂,骆孝志等.四川省巴塘县首次分离鼠疫菌的遗传学特征[J].中国媒介生物学及控制杂志,2015,26(3):258-261.
[5]杨晓燕,魏柏青,靳娟等.中国鼠疫耶尔森菌差异区段分型及其地理分布特征[J].中华流行病学,2014,35(8):943-948.
[基金项目：四川省卫生和计划生育委员会课题（四川省鼠疫耶尔森菌基因分型研究：16PJ397）
]＊