崔小冬*，白鲜籽，都兰，全霞，吴阿古达木
呼和浩特市蒙医中医医院，内蒙古 呼和浩特 010020
摘要 目的：建立高效液相色谱法测定波仁阿如-10丸中羟基红花黄色素A含量的方法。方法：采用高效液相色谱法对波仁阿如-10丸中的羟基红花黄色素A进行含量测定。色谱条件为：采用C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温35℃，以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至6.0±0.1）（19:2:79）为流动相，检测波长403nm，流速1ml/min，进样量20μl。结果：色谱峰分离情况良好，羟基红花黄色素A在4.66μg/ml～93.10μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.99998）；平均加样回收率为99.86%，RSD=1.17%（n=9）。结论：本法建立的含量测定方法简便、准确、专属性强、重复性好，可用于波仁阿如-10丸的质量控制。
关键词 蒙药；波仁阿如-10丸；高效液相色谱法；羟基红花黄色素A
波仁阿如-10是由诃子、红花、白豆蔻、五灵脂、紫花地丁、刀豆、枇杷叶、茜草、紫草、刺柏叶十味药材组成。具有清肾热的功能，用于肾热，肾损伤，小便不利，尿频，腰腿酸痛[1]，原散剂中含有枇杷叶、五灵脂、刺柏叶，服用时刺激咽喉，因此临床常用其丸剂来增加患者顺应性。红花为波仁阿如-10丸中的主药，具有活血通经、散瘀止痛等功效，羟基红花黄色素A为其主要活性物质。本试验参考比较2020年版《中国药典》中红花相关含量测定方法[2]以及《内蒙古蒙药制剂规范》2007年版[3]、《内蒙古蒙药制剂规范》2014年版[4]中指标性成分羟基红花黄色素A的不同含量方法，从而确定了以期为中心的髙效液相色谱的测定方法。这种含测方法操作时比较简单，专属性方面较强。截止到现在为止波仁阿如-10丸质量控制方面没有查到含量测定的相关研究或文章。该次试验采用的是高效液相色谱法，对于其中的指标性成分羟基红花黄色素A的含量进行定量测定，从而在质量控制方面，提供该制剂品种的检测依据。
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技(中国)有限公司）
QUINTIX35-1CN电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。
1.2试剂
甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水
1.3试药
羟基红花黄色素A对照品（批号111637-201810；纯度93.1%）购于中国食品药品检定研究院；波仁阿如-10丸（20210411、20210412、20210413）由呼和浩特市蒙医中医医院制剂室提供。阴性样品（自制）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（以
三乙胺调节pH值至6.0±0.1）（19:2:79）为流动相；检测波长为403nm，柱温35℃。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算，应不低于3000。
2.2 溶液制备
对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，加25%甲醇溶液制成每1ml含30μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约1.0g，精密称定，精密加入25%甲醇溶液25ml，称定重量，超声处理（功率120W，频率40kHz）40分钟，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。
阴性对照品溶液的制备 取阴性样品（缺红花）适量，研细，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。
2.3 测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察
取5.00mg羟基红花黄色素A对照品转入100ml容量瓶，加25%甲醇至刻度线摇匀，制成93.10μg/ml的对照品溶液。分别用艾本德移液器（100-1000μl）精密吸取0.5ml、1ml、3ml、5ml、9ml、10ml，之后转入10ml容量瓶，最后加溶剂至刻度，分别稀释成6个不同浓度的对照品溶液。然后分别吸取20μl注入高效液相色谱仪当中。以峰面积-浓度进行线性方程回归分析，最终结果表明羟基红花黄色素A在一定范围内线性关系良好，其范围为4.66μg/ml～93.10μg/ml，回归方程是y=52.14x-19.404，（r=0.99998，n=6）。
2.3.2 精密度试验
取2.2项下的羟基红花黄色素A对照品溶液，按照2.1项下的色谱条件连续进样6针，进样量20μl，其峰面积的平均值为1352.3，RSD为0.10%。说明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验
取同一批号样品（批号20210411）供试品溶液，在0h，2h，4h，6h，8h，16h的时间点按照2.1项下条件进行测定，羟基红花黄色素A的峰面积积分值分别为1508.4、1509.2、1507.2、1515.6、1510.2、1522.6，RSD值为0.39%，表明供试品溶液在16小时内稳定。
2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号20210411）6份，分别为1.0307、1.0323、1.0309、1.0312、1.0316、1.0315g，按照“2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行含量测定，羟基红花黄色素A的峰面积分别为1531.5、1559.7、1536.7、1540.2、1544.4、1544.4，含量为0.767、0.780、0.770、0.771、0.773、0.773mg/g，RSD值为0.57%，重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验
精密称定供试品（批号20210411）9份，每份约1g，分别置于9个25ml容量瓶中，按低中高不同浓度分成三组。每组分别用艾本德移液器（100-1000μl）加入羟基红花黄色素A对照品溶液（93.10μg/ml）6.87ml，8.59ml，10.31ml，（约相当于供试品含量的80%，100%，120%），再加入25%甲醇至刻度。照2.2项下的方法处理后分别20μl注入高效液相色谱仪中。最后得羟基红花黄色素A的平均回收率为99.86%，RSD为1.17%，结果见表1。结果表明：供试品中指标性成分回收率在98%以上，RSD值小于2.0%，表明方法准确度较好[5]。
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3 样品含量测定
对三批样品（20210411、20210412、20210413）按拟定的含量测定方法进行测定，按外标法计算羟基红花黄色素A成分的含量，结果分别为0.77、0.78、0.78mg/g，测定次数均为2次，RSD分别为1.28%、0.72%、0.72%。对照品、样品、阴性样品、空白溶剂测定色谱图见图1。
根据以上三批波仁阿如-10丸测定，样品中羟基红花黄色素A最低含量在0.77mg/g以上。样品所用红花药材中羟基红花黄色素A含量为12mg/g（1.2%），计算羟基红花黄色素A在该制剂中的转移率为67.54%，由于2020版《中国药典》一部“红花”药材中羟基红花黄色素A的限度为不得少于1.0%，按该限度折算样品中羟基红花黄色素A的理论含量不低于0.64mg/g（按100%出成率计算），结合转移率再下调10%[6]，因此暂定本品每1g含红花以羟基红花黄色素A（C27H30O15）计，不得少于0.58mg。
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4.1流动相的选择
通过采用《中国药典》2020年版一部“红花”项下、《内蒙古蒙药制剂规范》2014年版阿嘎如-10项下及《内蒙古蒙药制剂规范》2007年版奥·古日古木-13丸项下羟基红花黄色素A的含测方法测定对照品及样品，比较后最终确定流动相条件为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（以三乙胺调节pH值至6.0±0.1）（19:2:79），该条件下目标峰与其他成分达到较好的分离效果，峰型较好，保留时间合适。
4.2捉取溶剂的选择
在4.1项下溶剂均采用25%的甲醇，后增加50%甲醇溶液、甲醇进行同等条件下制备样品测定比较，25%甲醇提取样品含量测定结果高于其余两种溶剂，因而选用25%的甲醇溶液作为提取溶剂。
5 结论
采用高效液相色谱法测定蒙药波仁阿如-10丸中羟基红花黄色素A的含量，结果分离度良好。这种含测方法操作时比较简单，专属性方面较强，另外重现性较好。对于波仁阿如-10丸在质量控制方面，可以作为标准之一。
参考文献
[1] 卫生部药典委员会编．《中华人民共和国卫生部药品标准》蒙药分册1998年版[S] 北京：中国医药科技出版社，169.
[2] 国家药典委员会编．《中国药典》（一部）2020年版[S]．北京：中国医药科技出版社，157.
[3] 王伟 主编：康双龙，林燕，张丽娟副主编．内蒙古蒙药制剂规范[S]．呼和浩特：内蒙古人民出版社 2007：230-231．
[4] 王伟、高磊 主编：刘文茹，康双龙，林燕副主编．内蒙古蒙药制剂规范[S]．呼和浩特：内蒙古人民出版社 2014：63-64．
[5] 国家药典委员会编．《中国药典》（四部）2020年版[S]．北京：中国医药科技出版社，480-483.
[6] 内蒙古自治区食品药品监督管理局．内蒙古蒙药制剂规范注释（2007版第一 册下）[S]．内蒙古：内蒙古出版集团，2007．287-291．