杨宁 高若伊
青海大学医学院，青海省西宁市，810001
[摘要]：嗜盐微生物是一类新型的、极具应用前景和开发潜力的极端微生物资源，也是研究生命起源、生物进化和生物多样性的重要材料，近年来，我国对于嗜（耐）盐微生物的相关研究正处于起步阶段。本文将综合讨论介绍近年嗜盐微生物培养、分离、观察所用流程与方法，为以后的嗜（耐）盐微生物研究提供参考方法与理论基础。
[关键词]：盐湖嗜盐微生物，纯化分离，保存，分析
高盐环境通常指环境中盐的浓度高于海水，而可以在高盐环境中生存的古菌、细菌等则称为嗜盐微生物[1]，嗜盐微生物以其自身独特的盐胁迫适应机制生存于高盐环境中。目前，嗜盐微生物对高盐环境的盐胁迫适应机制已研究甚广，而它作为一种应用前景广阔的新型生物资源可在盐腌或盐发酵食品中作为添加剂 [2]，降解石油烃污染物[3]，化妆品制造,利用其耐盐基因创造耐盐植物[4]，制造生物电池[5]等，但其应用探索研究仍处于起步阶段。因此，对嗜盐微生物的系统鉴定、比较分析可为其资源开发利用奠定基础。
1.嗜盐菌的采集
嗜盐菌一般经分离富集获得的泥样、土样、盐卤水、高盐污水等样本得到；采集得到的土样、泥样在进行菌株分离培养时，建议使用无菌低浓度盐水振荡稀释[6]，以便进行下一步操作和保存。
2．嗜盐菌的分离培养
2.1嗜盐微生物分类
根据嗜盐菌对盐的适应能力的不同提出多种嗜盐微生物分类方法，其中最被广泛接受的是Kushner提出的根据嗜盐菌最适生长NaCl浓度进行分类的方法[7]，见表1。可根据嗜盐菌对NaCl的适应能力不同进行初步的筛选。
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2.2嗜盐微生物常用分离用培养基
酪素琼脂培养基[8]、甘油-门冬酰胺琼脂培养基[8]、高氏1号、RM培养基[9]、Gibbons培养基( Segal & Gibbons, 1960)[10]、LB培养基[11]、牛肉膏、碳源利用培养基、细菌培养基础培养基、蛋白酶菌筛选培养基[12]、蛋白酶菌发酵培养基、淀粉酶菌发酵培养基、脂肪酶菌筛选培养基、MNTA培养基[13]、TSA培养基、JCM培养基、GC培养基[14]、CＭ培养基[15]、MG培养基[16]、OSM 培养基(g/L)[17]；
2.3嗜盐微生物常用特征观察培养基
营养琼脂培养基(Nutrient Agar)、察氏培养基(Czapek's medium)、ISP4、ISP5[18]、ATCC213[19]培养基；PDA培养基[20]、酵母膏-麦芽膏琼脂、ISP3、羽毛粉培养基、人工海水[21]、MGM培养基[22]、富集培养基[23]。
3.嗜盐菌的分离纯化与保藏
3.1嗜盐微生物的分离纯化
固体培养基分离和纯化：稀释倒平板法，涂布平板法、平板划线法、稀释摇管法；液体培养基分离和纯化；单细胞（孢子）分离；选择培养分离：利用选择平板进行直接分离、富集培养；二元培养物。
3.2嗜盐微生物菌株的保藏
方法①：培养出的菌株，加入无菌液体石蜡于4℃下恒温保存
方法②：嗜盐菌菌落接种于斜面试管培养基保藏，每隔数月转接一次。菌液釆用甘油管进行保存，每个纯菌株保存两份。本法适合用于保藏中、长期储存期限的菌种。
方法③：对于短期内需使用的菌种，宜用平板低温保存法，在嗜盐微生物培养生长充分后，将平板转移至4℃冰箱保存，超过一定期限前应进行再次活化保存。
4.嗜盐微生物一般后续分析的流程
4.1嗜盐菌菌株 16S rRNA 基因组提取与测序
16S rRNA核苷酸序列长度适中，存在保守区与可变区，分别表示其亲缘性和差异性，可进行细菌分类学特征的研究。根据所测菌株序列特点设计引物，以16S rRNA为靶在适当条件下进行PCR扩增以得到扩增后片段，使用链终止法等方法对扩增后所得片段进行测序，并将扩增后所得序列与数据库中已有片段比对[24]，从而完成菌种的分类学分析。
4.2 构建系统发育树
系统发育树一般用于描述所测菌株之间的亲缘与进化关系。一般构建系统发育树需要根据所测菌株的16S rRNA测序结果构建，通过所测得结果与数据库比对初步判定菌株分类学定位，之后使用软件如MEGA进行系统发育树构建[25]。
4.3 生理生化试验鉴定
由于酶体系的不同，菌株对营养物质的利用、自身代谢后产生的代谢产物的种类、代谢类型等方面存在较大差异，这些差异可用于菌株的分类鉴定。
5.讨论与展望
我国具有丰富的高盐环境资源。通过研究嗜盐微生物的嗜盐机理，可将嗜盐微生物应用于医学生物材料与生物医药制剂的研发与制备、农业抗盐碱化工程、高盐污水处理系统、有机废水处理、生物酶开发和化妆品研发等领域[5]。同时也可以提高人们对于高盐生态系统和高盐环境下生命现象的认识。
通过对研究方法的汇总，可为之后欲进行嗜盐微生物实验研究的科研人员提供理论基础与研究思路。目前，针对盐湖微生物资源的认知和挖掘尚需深入研究。通过以上所总结的方法，有助于全面了解盐湖的极端环境微生物资源，对后续的开发利用具有重要意义。
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作者简介：杨宁（1999-），本科在读，研究方向：预防医学
作者简介：高若伊（1999-），本科在读，研究方向：预防医学