方旭1，赵 燕2，董美梅3，邓康宁4，徐莉娟5，张 芬6
王港社区卫生服务中心，上海，201201
【摘要】 胚胎干细胞是毒理学替代法中十分有效地研究工具，随着胚胎干细胞培养技术的发展，现广泛的用于体外发育毒性及其分子机制的相关研究。为了响应3R原则，减少实验动物的使用及避免种属差异性，胚胎干细胞体外研究近年来得到大力的推广与发展，尤其是3D培养技术的飞速进展。本文针对胚胎干细胞在替代毒理学中的具体应用进展进行阐述。
【关键词】 胚胎干细胞；替代毒理学；体外
替代毒理学作为毒理学重要的组成部分以及毒理学研究的主要方向之一，具有减少体内实验影响因素、减少动物使用、缩短实验周期、降低实验成本等多种优越性[1]。毒理学替代法的建立原则是以3R理论（Reduction-减少，Refinement-优化，Replacement-替代）为基础逐渐发展起来的，目前已用于一般毒性评价、肾脏毒性评价、心脏毒性评价、神经毒性评价、生殖发育毒性评价、遗传毒性和致癌毒性评价等。国内外对毒理学替代法的研究水平也渐渐从组织、细胞水平到蛋白质、基因。胚胎干细胞因具有全能性，可以分化为内胚层、中胚层和外胚层来源的多种细胞类型 ，进而有望在体外开展针对多靶器官的毒性评价[2]。目前在毒理学替代法中，胚胎干细胞是最广泛应用于毒性评价的细胞模型之一，在评价发育、胚胎毒性时有着巨大的优势：可以评价不同毒性（无毒、弱毒、高毒）的物质且评价时间周期短、灵敏度高等优点[3,4]。
1 胚胎干细胞试验的优化
1.1 细胞系及培养条件的优化
在替代毒理学所应用的领域，目前已经建立了大鼠、小鼠、灵长动物和包括人在内的胚胎干细胞系，同种种属物种有多种方式建系，不同的种属的胚胎干细胞系获得方式及培养条件也有所差异。小鼠的胚胎干细胞系有R1、 D3等干细胞系。诱导R1细胞系分化的因子有维甲酸、胎牛血清比例、VitC等。替代毒理学中常用的人胚胎干细胞有h1,h6,h9等细胞系。目前尚有一些研究者传统方法采用有饲养层有血清培养[5]，传统的培养方法虽然相对稳定，但使用的小鼠胚胎成纤维细胞和胎牛血清可能会含有微生物，影响实验结果及临床应用。因此，许多研究者逐渐采用有饲养层无血清培养的方法[6]。有研究者对饲养层的来源再进一步优化，用人源性细胞培养体系，如人成纤维细胞体系，有效降低了异源性[7]。无饲养层无血清培养体系相对前两种方法相对复杂，近几年在h4, h9,等人胚胎干细胞培养方法中均有此类方法的报道[8]。此外，有研究者发现基底的硬度对人胚胎干细胞的增值和分化也有很大影响，罗春花等人的研究发现，基底越硬，分化肝细胞的数目越多[9]。
1.2 实验方法的优化
胚胎干细胞试验的传统操作方法为期10天，已在药物、化妆品、食品安全等领域得到应用。近几年此实验方法也有所改进，主要是缩短实验周期和更换评估指标。缩短实验周期即可提高测试效率，亦可缩减人力和物力的成本。Roland Buesen等使用胚胎干细胞流式细胞术（FACS)-EST），有效的评估了体外发育毒性。这种方法与传统的10日法的区别在于第一步操作抑制ES分化观察方法，10日法采用观察收缩心肌细胞，7日法则采用流式细胞术检测肌球蛋白重链[10]。有研究者对上述方法又做了进一步改进，采用定量和客观指标来评估发育毒性[11]。实验的前五天对ES细胞进行培养、分化、染毒，第六天测内源性Hand1，该法检测体外毒性实验更加灵敏、快捷。
2 胚胎干细胞在毒理学研究中的应用和扩展
2.1 胚胎干细胞及高通量筛查
高通量筛查是证实胚胎干细胞内多功能调节器的有效测量手段[12]，已广泛应用于胚胎毒性、发育毒性、神经毒性、基因毒性等检测。 早在上个世纪九十年代已有相关研究采用此种方法筛检基因片段[13]。在如今采用复合参数指标的高通量筛查药物毒性[14]，高通量筛查技术越来越成熟。
高通量筛查在替代毒理学中应用的广泛性还体现在对胚胎干细胞来源或者胚胎干细胞分化的多能干细胞没有严格的要求。研究者可将来自人或者老鼠的胚胎干细胞诱导分化为特定类型的成体细胞，如心肌细胞，在此基础上用高通量测序评估某物质的相关毒性[15]。Meeyoung Cho等使用小鼠胚胎纤维母细胞培养的E14TG2a细胞系，给予一定浓度的丝裂霉素C后，用高通量筛查相关的分子或基因。
高通量筛查对基因和分子的检测有其独特的优势，但是由于筛检的量比较大，其费用也较为昂贵。
2.2 胚胎干细胞的定向分化技术在毒理学研究中的应用
胚胎干细胞作为全能干细胞，具有分化为多种细胞的可能，它的分化受内源性和外源性因素的调节，细胞内基因表达调控作用是主导其分化决定性因素[16]。胚胎干细胞的定向分化技术使得在替代毒理学中发挥重要功能，为体外试验的检测指标如细胞内蛋白质稳态、潜在的转录组网络等评估神经毒性、发育毒性等提供了可能性[17]。
替代毒理学中，常见的定向分化细胞包括神经细胞、心肌细胞等进而评估其相关毒性[18-20]。ES定向分化为血管内皮细胞的机制尚未完全清楚，Kit Man Tsang[21]等人研究发现在低氧的条件下MESC可以上调HIF1a的表达，进而调控 Etv2转录因子，影响MESC分化为动脉内皮细胞的结局。与此同时,有研究者[22]开始着手使用多能干细胞所分化的动脉血管内皮细胞模拟小分子物质对血管内皮细胞的毒性作用，该方法可以初步评价物质的血管毒性。也有相关研究[23]将胚胎干细胞分化大量软骨细胞，但技术尚不成熟，在培养基中加入何种生长因子以及浓度的确定尚需要进一步研究,有关使用胚胎干细胞分化入骨细胞进而评估其毒性的研究较少。
2.3 胚胎干细胞及“组学”技术在毒理学研究中的应用
在过去的二十年里，开展了很多的体外试验，这些试验有的使用的是胚胎干细胞，但是这些细胞与原始细胞从简单的细胞活性实验到复杂的细胞功能实验，可能结果都会有所差异。因此，在评估相关毒性时，选择合适的的检测终点、检测方法十分重要[24]。组学技术的应用使得这一应用的真实性获得很大的提高。常用的组学技术有蛋白质组学技术、转录组学技术、代谢组学技术。
转录组学技术在毒性评价中是比较成熟的技术，相对传统的评估方法，可以提供更多详细和准确的检测终点[25]。最近的一些研究对转录组学和统计学进行结合，综合性评估或预测发育毒性。vandartel等[26]使用转录组学技术预测化合物发育毒性的研究中，先将十二种化合物对胚胎干细胞进行染毒，然后通过转录组学技术使用胚胎干细胞生物标志基因预测物质的发育毒性，其成功率为67%。蛋白质组的研究相对转录组而言更为复杂，其研究水平受科技水平的限制比较大，在替代毒理学的应用上受较大的限制。尽管在蛋白质组的研究上投入了大量的物质和努力，应用依然面临诸多瓶颈[27]。蛋白质的多样性也使建立较为完善的蛋白组数据库难度增加。许多研究通过测定细胞内某些蛋白质水平表达的差异，评估物质对胚胎干细胞发育毒性/胚胎毒性[28-29]。代谢组学的发展相对蛋白质组学和转录组学起步较晚，目前在替代毒理学相关领域的研究尚不多见。多数研究尚局限在胚胎干细胞分化成多能干细胞后新陈代谢方面的差异鉴定[30-31]，也有研究者使用代谢组学技术在代谢途径上分析体细胞如何去分化获得多能干细胞[32]。这些研究者的研究思路为代谢组学在替代毒理学的应用上提供了思路。
3 展望
胚胎干细胞在替代毒理学的应用方面具有广阔的空间，也面临着技术和伦理方面的挑战。随着技术的发展，越来越多的物种可建立胚胎干细胞系，未来胚胎干细胞有望在体外分化成独立的组织、拟器官甚至是器官，为毒理学评价提供更为科学、直观的依据。丰富的胚胎干细胞系以及可分化的细胞、组织、器官，为更精确的体外评估化合物各种毒性提供了基础。高通量筛查技术的不断发展，各类灵敏的检测终点的出现也使毒性的评估和预测更加的简便和精确。另一方面，由于物种多样性、基因多样性、蛋白质多样性的存，在技术方面也不断提出更高的要求及技术改进与新技术的出现也可能会导致伦理学问题。
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作者简介：方旭 男 中共党员 安徽蒙城县人 1990.8～ 蚌埠医学院学士学位 公共卫生中级职称 上海市浦东新区王港社区卫生服务中心防保科 上海市浦东新区虹盛路25号 201201 E-mail:1257302553@qq.com。