陈果1，温浩瑄2，李川1，周良君1，唐宇1，王学军1，杨红1，王乐1，汪洋1
1.绵阳市疾病预防控制中心，四川绵阳 621000
2.武汉大学健康学院 湖北武汉 430000
摘要：目的 了解样本不同前处理方式对新冠核酸检测的影响，为痰液和粪便新冠核酸检测提供前处理依据，保证实验检测的灵敏度和准确性。方法 对新型冠状病毒核酸检测阳性的痰液和粪便标本采用不同的前处理方式后进行核酸提取，实时荧光PCR进行检测，用配对设计（自身配对设计）资料的t检验方法分析样本CT值差异有无统计学意义。结果 以病毒保存液（不灭活）组作为参照方法，56℃60min灭活，蛋白酶K溶液和Trizol试剂处理组痰液和粪便标本CT值差异无统计学意义。痰液标本4%NaOH处理组与参照方法组相比CT值差异有统计学意义（靶标ORF1AB、N和内标t值分别为7.29、9.285和7.654，自由度v=4，P值均＜0.05），4%NaOH处理组CT值较高。结论 应在检测前对痰液和粪便标本56℃60min灭活处理，不能采用4%NaOH处理痰液，蛋白酶K溶液和Trizol试剂处理样本对核酸检测没有显著影响，可根据本实验室情况进行选择。
关键词：新型冠状病毒；核酸检测；前处理
Effect of pretreatment methods on nucleic acid detection of
sputum and fecal samples for SARS-CoV-2
CHEN Guo1， WEN Haoxuan2， LI Chuan1，ZHOU Liangjun1，TANG Yu1，WANG Xuejun， YANG Hong1， 1WANG Le1，WANG Yang1
1.Mianyang Center for Disease Control and Prevention,621000
2.Wuhan?University?School?Of?Health?Sciences,Hubei?430071,China
Abstract: objective to understand the influence of different sample pretreatment methods on nucleic acid detection of SARS-CoV-2, and to provide the basis for the nucleic acid detection of SARS-CoV-2 in sputum and fecal samples, so as to ensure the sensitivity and accuracy of the test. Methods the SARS-CoV-2 nucleic acid positive sputum and feces specimens were extracted by different pretreatment methods, Then the nucleic acid was extracted and real-time PCR was performed and detected by real-timefluorescencequantitativePCR. The t test method of paired design (self control design) was used to analyze whether there was statistical significance in the CT value of samples pretreated different methods. Results The virus preservation solution (non inactivated) group was used as the reference method ,there was no significant difference in CT values of sputum and feces between the reference method group and the inactivated group ,or the protease K solution pretreatment group ,or the Trizol reagent pretreatment group. there was significant difference in CT values of sputum between the reference method group and the 4% NaOH pretreatment group（ Target ORF1ab：t= 7.29，v=4，P < 0.05；Target N ：t=9.285，v=4，P < 0.05； Target internal markers: t=7.654, v=4，P < 0.05）CT value of the 4% NaOH pretreatment group was higher. Conclusion sputum and fecal samples should be inactivated at 56 ℃ for 60 min before detection, 4% NaOH should not be used for sputum treatment. The pretreatment with proteinase K solution and Trizol reagent have no significant effect on nucleic acid detection of SARS-CoV-2.
Keywords: SARS-CoV-2; nucleic acid detection; pretreatment.
项目：绵阳市科技项目
项目名称： 实时荧光RT-PCR检测技术在诊断新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病例中的应用
项目编号：2020YJKY018
由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的2019冠状病毒病（COVID-19）疫情于2019年12月首先暴发于湖北武汉，随后蔓延至全国。冠状病毒为单股正链的RNA病毒，有包膜，新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β属。病毒对紫外线和热敏感，56℃30分钟、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。基于目前的流行病学调查和研究结果，潜伏期为1~14天，多为3~7天；传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，无症状感染者也可成为传染源；主要传播途径为经呼吸道飞沫和接触传播，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能，其它传播途径尚待明确；人群普遍易感。［1，2］
目前常用于新冠病毒核酸检测的样本有咽拭子，鼻咽拭子，深咳痰液，粪便等。其中痰液和粪便标本成分和性状较为复杂，检验前需进行适当的前处理，为最大限度的保证检测工作质量，尽可能做到准确及时不漏检。本实验室对不同方式进行前处理的痰液及粪便样本进行了新冠病毒核酸检测及结果分析。现将结果报告如下。
1.材料与方法
1.1材料 本中心对新型冠状病毒确证患者和无症状感染者检测呈阳性的痰液和粪便标本各5份。
1.2试剂和仪器 采用硕世生物科技股份有限公司生产的全自动核酸提取仪（SSNP-2000A）和核酸提取试剂盒进行核酸提取；采用硕世生物科技股份有限公司和上海伯杰医疗科技有限公司生产的新型冠状病毒病毒核酸检测试剂盒（ORF1ab/N）；采用ABI7500型实时荧光PCR仪和罗氏LightCycler 480Ⅱ型实时荧光PCR仪进行核酸检测。痰液及粪便样本处理采用ThermoFisher公司生产的Trizol试剂；Solarbio品牌的蛋白酶K溶液（10mg/ml）；友康病毒采样管中病毒保存液及实验室自配4%NaOH溶液。
1.3方法
1.3.1实验室按照《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》［3］制定本实验室SARS-CoV-2检测工作SOP。
1.3.2 实验样本制备 痰液样本（采集于3ml病毒保存液中的痰液标本充分震荡混匀作为实验用均一样本；粪便样本用接种环挑取约4g加入到2mL病毒保存液中充分震荡混匀作为实验用均一样本。
1.3.3 样本前处理：
1.3.3.1 痰液：将实验用均一样本分别取100μL：（1）于100μL蛋白酶K溶液（10mg/ml）中震荡混匀后静置作用15min；（2）于100μL Trizol试剂中震荡混匀后静置作用15min；（3） 于100μL病毒保存液中震荡混匀后56℃60min灭活；（4）于100μL病毒保存液中震荡混匀，不灭活；（5）于100μL4%NaOH溶液4%中震荡混匀后静置作用15min。
1.3.3.2 粪便：将实验用均一样本分别取100μL：（1）于100 μL蛋白酶K溶液（10mg/ml）中震荡混匀后静置作用15min；（2）于100μL Trizol试剂中震荡混匀后静置作用15min；（3） 于100μL病毒保存液中震荡混匀后56℃60min灭活；（4）于100μL病毒保存液中震荡混匀，不灭活。
1.3.4 核酸提取和实时荧光PCR法检测：按试剂盒说明书及仪器操作SOP进行操作及结果判读。
1.3.5 实验室生物安全
1.3.5.1实验室严格按照《新型冠状病毒病毒实验室生物安全指南》［4］制定生物安全工作规程及应急预案，实验人员均经过生物安全培训并考核合格。
1.3.5.2进行样本处理、核酸提取工作按照三级生物安全防护；核酸检测工作按照二级生物安全防护。
1.3.5.3实验后立即将本次实验产生的医疗废弃物包括个人防护装备高压灭菌处理（121℃30min），同时采用化学指示条对高压灭菌效果进行监测，实验室定期（每月2次）用生物指示剂对高压灭菌效果进行监测，高压灭菌后的医疗废弃物及时移交到中心的医疗废弃物暂存点。做好相关记录。
1.4统计分析?数据采用SPSS16.0软件进行统计分析。采用t检验对关联样本进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 不同前处理方式的痰液标本检测结果 对5份实验用均一痰液样本（A1-A5）分别采用不同的前处理方式（见1.3.3）处理后进行实时荧光PCR法检测新型冠状病毒ORF1ab靶标，N靶标和内标基因，检测结果（CT值）见表1
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2.2 不同前处理方式的痰液标本检测结果统计学分析 以病毒保存液（不灭活）组作为参照方法，计算每种方法与参照方法的差值，样本灭活，蛋白酶K处理和Trizol试剂处理的痰液样本CT值差异无统计学意义（P＞0.05）；4%NaOH处理组结果差异有统计学意义（P＜0.05），4%NaOH处理组的ORF1ab,N和内标基因CT值均较高。说明4%NaOH处理痰液样本对核酸破坏较大，显著影响病毒核酸检出，见表2 。
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2.4 不同前处理方式的粪便标本检测结果统计学分析 以病毒保存液（不灭活）组作为参照方法，计算每种方法与参照方法的差值，样本灭活，蛋白酶K处理和Trizol试剂处理的痰液样本CT值差异均无统计学意义，见表4。
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3.讨论
对呼吸道标本来说，拭子样本采样质量较难直观看到（且鼻咽拭子对采样技术要求较高），肺泡灌洗液标本对病人伤害较大一般难以获得且不适用于轻症病例及无症状人群，深咳痰液为病毒含量较高且更容易保证采样的质和量的理想样本，与陈炜，吴建国等的报道一致[5,6,7]。粪便标本在部分呼吸道标本检测阴性的疑似病例确诊及是否达到出院标准的判定中也有其不可替代的作用和意义。[6,8,9]
痰液和粪便标本成分和性状较为复杂，检验前需进行适当的前处理，且前处理工作可能给检验人员带来更高的风险。本研究旨在评估样本灭活及不同前处理方法对检测效果的影响，为制定适合本实验室的安全可靠的检验策略提供依据。
本实验室研究数据表明，56℃60min灭活对核酸检测CT值没有显著性影响，与钟慧钰等[10]的报道一致。建议在检测痰液和粪便标本前先进行灭活处理以保护检验人员。
3. 本实验室研究数据表明，对痰液样本和粪便样本来说，蛋白酶K处理，Trizol试剂处理及加入病毒保存液充分震荡混匀处理的核酸检测CT值没有显著性差异，实验室可根据自身情况进行选择。
4%NaOH处理痰液对检测结果影响较大，CT值显著增高，致使部分样本无法检出。说明4%NaOH处理痰液样本对核酸破坏较大，在工作中不能采取该方法处理痰液标本 。
综上，在新型冠状病毒SARS-CoV-2的核酸检测工作中，深咳痰液和粪便标本有其不可替代的重要作用。应在检测前对痰液和粪便标本56℃60min灭活处理，不能采用4%NaOH处理痰液，蛋白酶K溶液和Trizol试剂处理样本对核酸检测没有显著影响，可根据本实验室情况进行选择。
参考文献
[1]新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）.[S/OL]. （ 2020-03-03 ） [2020-03-04].http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s7653p/202003/46c9294a7dfe4cef80dc7f5912eb1989.shtm
[2]中华人民共和国国家卫生健康委员会.新型冠状病毒肺炎防控方案（第六版）.[S/OL]. （ 2020-03-07 ） [2020-03-07]. http://www.nhc.gov.cn/jkj/s3577/202003/4856d5b0458141fa9f376853224d41d7.shtml
[3]新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南.[S/OL]. （ 2020-02-21 ） [2020-02-21].http://www.nhc.gov.cn/jkj/s3577/202002/a5d6f7b8c48c451c87dba14889b30147.shtml
[4]新型冠状病毒病毒实验室生物安全指南（第二版）.[S/OL]. （ 2020-01-23 ） [2020-01-23]..http://www.nhc.gov.cn/qjjys/s7948/202001/0909555408d842a58828611dde2e6a26.shtml
[5]陈炜，张春阳，朱颖，等 .4 例新型冠状病毒感染病例咽拭子与痰标本病毒核酸检测的比较．中国人兽共 患病学报. http://kns.cnki.net/kcms/detail/35.1284.R.20200211.2118.002.html
[6]吴建国，罗建飞，刘家盛，等 . 重型 / 危重型新型冠状病毒肺炎患者多种生物样本核酸检测结果分析［J］. 解放军医学院学报，2020，41（3）
[7]李泉，刘钉宾，乔正荣，等 .SARS-CoV-2 IgM/IgG 抗体检测在新型冠状病毒肺炎诊断中的价值．国际检验医学杂志. http://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20200304.1041.006.html
[8]李萍，赵四林，陈煜枫，等 .2 例新型冠状病毒肺炎粪便 SARS-CoV-2 核酸阳性临床启示．国际检验医学杂志. http://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20200213.1516.002.html
[9]李宝林，李芹，吴刚，等 .15 例 COVID-19 患者治疗后痰、粪便标本新型冠状病毒核酸检测结果比较[J/OL]．中国感染控 制杂志. http://kns.cnki.net/kcms/detail/43.1390.r.20200306.1240.002.html
[10]钟慧钰，赵珍珍，宋兴勃，等 .新型冠 状病毒核酸临床检测要点及经验．国际检验医学杂志. http://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.r.20200227.0936.002.html
作者简介：陈果（1982-），女，副主任技师，主要从事微生物检验工作