马丽丽1 冯雪2 白宇 3 杨雪4
1.2.4.佳木斯市食品药品检验检测中心 154000
3.黑龙江中医药大学附属第二医院团委 150000
【摘 要】目的：细菌霉素是革兰氏阴性菌的重要组成，当细菌死亡或者自然溶解之后便会释放出内毒素，这种毒素在自然界广泛存在，进入人体并不会对人体产生危害，但毒素大量进入血液便会引起热源反应，给人们身体健康构成威胁，这里主要通过建立定量检测茵栀黄注射液中的细菌内毒素试验方法。方法：结合《中国药典》附录中的茵栀黄注射液中细菌内毒素的检测方法，并分析了其有关干扰因素。结果：采用动态浊度定量检测茵栀黄注射液中细菌内毒素的时候，几乎不受外在因素的干扰，内毒素回收率高达80%以上。结论：使用动态浊度定量检测进行茵栀黄注射液中细菌内毒素，效果十分好，有着良好的临床价值且值得推广，这种方法代替了传统免热源检查方法，又避免了限量法内毒素检测干扰。
【关键词】茵栀黄注射液；动态浊度定量检测；细胞内毒素；检测
茵栀黄注射液是当前临床中常见灭菌水溶液药剂，有着清热、解毒、退黄的作用，在肝胆湿热、胸肋胀痛、慢性肝炎等临床中十分常见，这种药物主要是为茵陈提取物、金银花提取物和栀子提取物以及黄芪苷加工而成。由于茵栀黄注射液临床应用范围广、价值高，其在热源控制中有着良好的临床价值，这也让其细菌内毒素检测受到人们的关心，使得细菌内毒素在预计限值内，保证了用药安全、采用动态浊度定量检测法进行茵栀黄注射液中细菌内毒素检测，其可靠性、抗干扰能力强，结果较为准确。
1、材料与仪器
本次试验采用了茵栀黄注射液，批号为20090206，由江苏长江药业有限公司生产。TAL试剂为20080208，由湛江海洋生物有限公司提供，细菌内毒素按照国家现行规定进行检测。细菌用水为湛江海洋生物制品检定厂提供。
2、方法与结果
细菌内毒素这个概念最早出现于十九世纪九十年代，最早主要是引发热物质变化引起人们关注的内容。到了上个世纪中期随着生物学、物理学、化学、免疫学和医学的进一步发展，细菌内毒素研究力度不断增加，成为医学、药学人士研究的重点，其化学结构组成成分以及各生物活性之间的关系变得更加明确，对其研究也越来越深入。目前，细菌内毒素限制可以用公式进行确定，公式为：L=K/M，其中K为规定的给药途径，也就是人体每千克体内1小时之内能够接受最大内毒素计量，通过注入5EU/kg；M为小时内每千克体质量的人最大给药剂量为10ml/kg，由此计算得出样品中的内毒素限值为0.5EU/ml·L。
2.1标准曲线的制备
用细菌内毒素检查，用水将内毒素按照国家规定标准的10倍以及2倍进行稀释，最终细菌内毒素浓度分别确认为0.5,0.25,0.125,0.062以及0.031EU/ml。分别提取这些细菌内毒素中的0.1ml，让试剂反应管内部搅拌均匀，插入BET-32C细菌内毒素测定仪器进行检测，其中每个反应管内部结果不一样，具体如下表1所示。根据回归方程式：lgT =3.029 - 0.330 4 lgC, 其中相关系数r=0.0987，最低浓度为0.0313，空白对照管在检测时间外，因此这里不进行分析。
.png)
2.2 样品溶液配制及干扰试验
将复方丹参注射液用内 毒素检查用水依次稀释为 2, 4, 8, 16 倍溶液, 记为 Ai 液;同时 另取 4 管, 进行同样倍数稀释, 但在稀释液中添加浓度为 M ( 4λ1) 的细菌内毒素标准溶液;作为样品添加内毒素阳性对照 管, 记为 Bi 液;分别取上述各液 0 .1 mL, 加入预先加有 0.10 mL TAL 试剂的反应管内, 混匀立即插入 BET -32C 细菌内 毒素测定仪内进行检测, 其中每个浓度重复 3 管, 计算回收 率。 回收率( %) =( Bi 液内毒素值-Ai 液内毒素值) ×M -1 × 100%。结果见表 2。 标准曲线:lgT =3.029 -0.330 4 lgC, r = -0 .998 7。 样品的添加内毒素平均回收率 50%～ 200 %, 符 合《中国药典》2000 年版规定, 表明样品的 4 个浓度溶液对鲎 试剂无干扰影响。
.png)
2.3样品溶液正式试验
分别取 4 批茵栀黄注射液, 用细菌 内毒素检查用水制成 4 倍稀释液, 记为 Ai 液;同时另取 4 管 进行 4 倍稀释, 并在稀释液中添加浓度为 M( 4λ1) 的细菌内毒 素标准溶液, 记为 Bi 液;分别取上述各液 0 .1 mL, 加入预先 加有 0 .10 mL TAL 试剂的反应管进行检测, 其中每个浓度重 复 3 管, 计算回收率。 结果 4 批供试品的家兔热原检查结果 一致, 均为阳性, 见表 3 。 标准曲线:lgT =2.928 -0.302 7 lgC, r =-0 .998 8, 4 批复方丹参注射液的回收率为 50 %～ 200 %, 表明茵栀黄注射液在本实验条件下对 TAL 试剂无干 扰影响, 因此日常检验选用 4 倍即可。
.png)
3 讨 论
根据茵栀黄注射液的干扰试验结果我们发现，茵栀黄注射液采用动态浊度定量检测法效果明显，细菌内毒素回收率高达50~200%，其中并不存在其他干扰因素和影响因子。就本次试验中的4批茵栀黄注射液的内毒素含量进行检定，其含量均在规定限度 0.5 EU/ mL 以下。 用传统的家兔法检测细菌内毒素, 由于操作复杂, 影响因 素多, 对试验结果影响很大。 利用动态浊度法进行细菌内毒 素定量检测, 具有操作简便、结果准确、检测灵敏度高等优点, 尤其避免了由于家兔差异及人为主观判断所出现的假阳性或 假阴性结果。 经过对比试验, 样品的细菌内毒素定量检测结 果与家兔热原检测结果一致, 说明使用细菌内毒素动态浊度 法测定复方丹参注射液的细菌内毒素是可行的, 可用细菌内 毒素定量检查法代替家兔热原检查法。
参考文献
[1]雷迪, 尹俊艳. 茵栀黄注射液治疗肝移植术后高胆红素血症对患者同型半胱氨酸和γ-谷氨酸转肽酶的影响[J]. 世界中医药, 2019, 014(011):3013-3015,3019.
[2]熊冉冉. 茵栀黄注射液联合丁二磺酸腺苷蛋氨酸肠溶片治疗妊娠期肝内胆汁淤积症患者的疗效分析[J]. 首都食品与医药, 2019, 026(024):P.82-82.
[3]朱昱, 张军霞, 周继春,等. BN大鼠和RBL-2H3细胞作为茵栀黄注射液过敏反应模型的可行性研究[C]// 中国药理学会药检药理专业委员会第十六届（2019年）学术年会论文集. 2019.
注：
白宇3基金项目：黑龙江中医药大学校科研基金项目：2019MS30