郝立月，陈嘉荣，刘杰
西南医科大学公共卫生学院实验教学中心，四川泸州，064100
摘要：目的 研究邻苯二甲酸二丁酯对新生雄性大鼠神经行为发育的影响，为邻苯二甲酸二丁酯的神经行为毒性防治提供科学依据。 方法 将40只新生雄性大鼠随机分为高、中、低、溶剂剂量组（500.00、100.00、50.00、0mg/kg）和空白组5组，每组8只。在大鼠出生后第5天开始染毒，连续染毒7天。用平面翻正、负趋地性、悬崖回避、前肢握力试验测试新生雄性大鼠的神经行为发育。 结果 体重：染毒剂量与日龄无交互作用（F染毒剂量*日龄=0.72，P>0.05）。日龄对体重有影响（F=104.33，P<0.001），新生雄性大鼠体重随日龄的增加而增加（P<0.05）。染毒剂量对体重有影响（F=5.84，P<0.001），中、高剂量组大鼠体重低于低剂量组、溶剂剂量组和空白组（P<0.05）。平面翻正：染毒剂量与日龄无交互作用（F染毒剂量*日龄=35.00，P>0.05）。日龄对平面翻正反射结果有影响（F=33.00，P<0.001），随着日龄的增加平面翻正试验时间呈现为下降趋势（P<0.05）；染毒剂量对平面翻正结果有影响（F=6.17，P<0.001），中、高剂量组大鼠平面翻正反射试验时间高于低剂量组、溶剂剂量组和空白组（P<0.05）。前肢握力：不同染毒剂量对前肢握力试验结果有影响（F=3.74，P=0.01），中、高剂量组大鼠前肢握力试验时间低于低剂量组、溶剂剂量组和空白组（P<0.05）。负趋地性、悬崖回避：染毒剂量与日龄对负趋地性结果无交互作用（F染毒剂量*日龄=1.49，P=0.16），日龄对负趋地性试验结果无影响（F=1.36，P=0.26），染毒剂量对负趋地性试验和悬崖回避试验结果均无影响（F负趋地性=2.58，P=0.06；F悬崖回避=1.10，P=0.37）。结论 邻苯二甲酸二丁酯对新生雄性大鼠的神经发育有抑制作用。
关键词：邻苯二甲酸二丁酯；神经发育；新生雄性大鼠
The effects of Dibutyl phthalate on neurobehavioral development of neonatal male rats
HAO Liyue，CHEN Jiarong，LIU Jie
（School of Public Health, Southwest Medical University，Sichuan，Luzhou 646000，China）
Abstract: Objective To study the effects of Dibutyl phthalate on the neurobehavioral development of neonatal male rats, so as to understand the impact of DBP on the neurobehavioral development of neonates. Methods 40 pregnant male rats were randomly divided into high, medium, low, solvent dose (500.00, 100.00, 50.00, 0mg/kg) and blank group, each group of 8. 5 day old rats were exposed for seven days. Using plane righting, negative geotaxis, cliff avoidance, forepaw grip detection test in rats the development of the nervous behavior. Results which were mainly affected by the weight of DBP exposure（F=5.84，P<0.001） and age（F=104.33，P<0.001), and the exposure and the age of interaction had no significant effects on body weight (F =0.72，P>0.05).Age had an effect on the plane righting reflex (F=33.00, P<0.001), exposure had an effect on the plane righting reflex (F=6.17, P<0.001), and the test time in the high-dose group and medium-dose group was higher than that of the low-dose group, solvent-dose group and blank group (P<0.05).The forepaw grip test, DBP exposure (F=3.74,P=0.01) have the effects on the experimental results, the high dose group and medium dose group was lower than that of the low dose group, the solvent group and the blank group (P<0.05). The exposure and the age of interaction had no significant effects on negative geotaxis test（F=1.49，P=0.16）,and the age had no effect on the results (F=1.36, P=0.26). The exposure had no effect on the negative geotaxis and cliff avoidance results (negative geotaxis, F=2.58, P=0.06; cliff avoidance, F=1.10, P=0.37). Discussion Dibutyl phthalate inhibited the neurodevelopment of neonatal male rats.
Key words: Dibutyl phthalate; neural development; immature male rats
邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate, DBP）是邻苯二甲酸酯类化合物（phthalates，PAEs）的重要组成部分，常作为聚氯乙烯等的增塑剂、软化剂得到广泛的应用，同时也是生产油漆、粘接剂、杀虫剂、儿童玩具等多种工业品的重要原料[1-3]。研究表明DBP可通过多种途径进入人体，包括消化道、呼吸道、医疗处理等[4,5]。流行病学数据表明，DBP具有神经毒性，可引起脑功能的改变[6-8]。研究表明，当DBP染毒剂量为25mg/(kg·d)时能够导致雄性子代幼鼠的神经行为发育改变，但是当染毒剂量在225mg/(kg·d)时却没有类似的神经行为异常表现[9]。还有研究证明DBP在怀孕期极低剂量（10ug/(kg·d)）染毒可导致成年雄鼠情绪不稳定[10]。此外，注意力缺陷多动障碍综合征可能和学龄前DEHP暴露剂量紧密相关[11]。综上所述，提示DBP对神经组织的损害可能不是严格地线性关系，即DBP的剂量在一定范围内时不会导致神经毒性，而高于或者低于这个范围则可能会出现发育异常。所以仍具有不确定性。故本研究以不同浓度剂量的DBP为受试物，通过对出生后5天的新生雄性大鼠进行染毒，采用神经行为能力测定实验评价DBP对新生雄性大鼠的神经行为发育的毒性作用，为DBP神经行为发育毒性的防治提供科学依据。
1对象与方法
1.1实验动物、分组及其染毒
1.1.1实验动物 采用20只相同孕期的特定病原体（SPF）级SD孕鼠（由西南医科大学动物实验中心提供）。孕鼠被饲养在照明良好的饲养室，湿度控制在（50±10）%，室温控制在（24±1）℃，采用喂养的方式，每24h换一次垫料，每7d进行一次消毒。并在每天8:00以及18:00对孕鼠的生育情况进行检查，若有新生大鼠出生则记为出生后0天（PND0），若该新生大鼠是在18:00后出生则顺至第二天，记第二天为PND0。
1.1.2分组 孕鼠分娩后，抽取于同一天出生的8窝新生大鼠为实验对象，在每一窝中随机抽取5只新生雄性大鼠，随机分到低、中、高、溶剂剂量组和空白组5组，每组各8只。
1.1.3 染毒 在新生雄性大鼠PND5至PND11进行染毒。将DBP溶于植物油中，溶剂剂量对照组、低、中、高剂量组分别按照0、50.00、100.00、500.00mg/kg对新生雄性大鼠进行灌胃，每天一次，时间固定在18:00。空白组不做任何特殊处理。
1.2 实验材料及仪器 DBP、动物饲料、饲养笼垫料（由西南医科大学动物实验中心提供）、植物油（金龙鱼植物花生油）、自制简易神经行为发育实验设备：包括平面翻正、负趋地性、悬崖回避、前肢握力设备（由西南医科大学公共卫生实验教学中心提供）。
1.3 新生雄性大鼠神经行为发育能力的测定 在新生雄性大鼠PND12龄时开始。神经行为学测定试验包括：平面翻正、负趋地性、悬崖回避反射和前肢握力试验。所有动物神经行为发育能力测定试验均在相同条件下进行，控制实验室室温、相对湿度、分贝等环境条件，使其与饲养室保持一致，测试的时间段选择在新生雄性大鼠行动最活跃的晚上19:00-23:00。每次测试顺序采取随机原则，同一窝别的新生雄性大鼠全部测试完成后，再进行下一窝别的测试，每只新生雄性大鼠的测试都单独完成，每次测试完成后都迅速将其送回对应的饲养室中。尽可能地减少其他因素对新生雄性大鼠造成的影响，减少不必要的误差。
1.3.1平面翻正[12] 小心地从饲养室中抓出新生雄性大鼠，将其背部朝下，腹部及四肢朝上，放置在一块事先预热至33℃的光滑平板上，在松开大鼠的同时按下秒表，记录下大鼠从四肢朝上的平躺状态到翻正四肢全部触碰到平板所使用的时间，记录下的时间保留到小数点后两位。PND12、14、16、18四个时间节点作为重复测量的时间节点，每一时间节点做三次测验，最终结果取三次数据的平均值。
1.3.2负趋地性[1] 准备一个表面粗糙与水平面构成30°倾斜的斜面，将新生雄性大鼠腹部面向斜面，头部朝向斜下方，使其头尾两点形成的连线与该斜面平行，放置于该斜面上，在松开大鼠的同时按下秒表，记录下大鼠从头部朝向斜下方到转身180°头部朝向斜上方所使用的时间。时间上限设置为60秒，若大鼠未在规定时间内完成转身，或直接爬至斜面底部，或发生滑落，则记时间为60秒，记录下的时间保留到小数点后两位。PND12、14、16、18四个时间节点作为重复测量的时间节点，每一时间节点做三次测验，最终结果取三次数据的平均值。
1.3.3悬崖回避[12] 准备一个高约10cm的试验台，将新生雄性大鼠置放于该试验台上，使其头部及前肢超过试验台的边缘，并用手固定住大鼠的位置，在松开大鼠的同时按下秒表，记录下大鼠从试验台边缘转身离开或退回离开所使用的时间，记录下的时间保留到小数点后两位。于PND12进行测验，检测三次，最终结果取三次数据的平均值。
1.3.4前肢握力[13] 在一个高约40cm的平台的一侧边缘处固定一根金属细杆，细杆直径为1.5mm，在该侧正下方放置一防止新生雄性大鼠摔伤的软垫。将大鼠的前肢放置于金属细杆上，观察，待到大鼠主动用其前肢握住金属细杆后，松开大鼠的同时按下秒表，记录下大鼠前肢握住金属细杆所持续的时间，记录下的时间保留到小数点后两位。于PND12进行测验，为了避免大鼠没有持续性前肢悬挂的意识，该试验重复测验三次，最终结果取三次数据的最大值。
1.4 数据录入与分析 用SPS 毒剂量为组间因素，采用两因素重复测量方差分析方法进行分析，两两比较采用LSD法，P<0.05认为差异有统计学意义。
2结 果
2.1 DBP对新生雄性大鼠体重的影响 染毒剂量与日龄对新生雄性大鼠体重的影响无交互作用（F染毒剂量*日龄=0.72，P>0.05）。日龄对体重有影响（F=104.33，P<0.001），新生雄性大鼠的体重随着日龄的增加而增加（P<0.05）。染毒剂量对体重有影响（F=5.84，P<0.001），中、高剂量组大鼠体重低于低剂量组、溶剂剂量组和空白组（P<0.05）。见表1
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2.2.2 负趋地性试验 日龄与染毒剂量对负趋地性试验结果无交互作用（F染毒剂量*日龄=1.49，P=0.16）。日龄对负趋地性反射试验结果没有影响（F=1.36，P=0.26）。染毒剂量对负趋地性反射试验结果没有影响（F=2.58，P=0.06）。见表3。
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2.2.4 前肢握力试验 染毒剂量对新生雄性大鼠前肢握力试验结果的影响有显著差异（F=3.74，P=0.01），中、高剂量组大鼠前肢握力试验时间明显低于低剂量组、溶剂剂量组和空白组（P<0.05）。见表5。
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3讨 论
空白组、溶剂剂量组和低剂量组的新生雄性大鼠体重明显高于中、高剂量组，说明新生雄性大鼠体重受到了DBP染毒的影响，中高剂量染毒可抑制雄性大鼠早期体重的增长。但体重指标只是评价实验动物健康发育情况的众多因素评价指标之一，故为了进一步探究DBP暴露对新生雄性大鼠健康发育的影响，还应该进一步的研究其他生长指标。
平面翻正反射试验主要是用于衡量动物左侧和右侧身体运动是否协调以及该功能的发育情况[1]；负趋地性指的是机体对地心引力的定向反应，其表现为背地心运动[14]；悬崖回避反射实验主要用于评价动物的感觉功能；前肢握力实验检测的是大鼠肌肉力量和机体平衡发育能力[15]。本次实验中发现，中、高剂量组大鼠平面翻正所需时间明显高于溶剂剂量组和空白组，表明新生雄性大鼠左右侧协调运动在中高剂量染毒水平就受到了影响，共济运动功能发育受到了抑制。负趋地性、断崖回避试验组间无差异，表明本次研究中DBP剂量水平还不足以对大鼠的背地心运动和感觉功能产生影响，这与李元峰的研究结果类似[16]，猜测这可能是雄性大鼠的海马组织在该水平染毒剂量下没有受到损害或仅受到轻微的影响但不造成功能性损害。前肢握力试验结果显示，中、高剂量组前肢握杠持续时间均低于溶剂剂量组和空白组，说明中高剂量染毒水平抑制了新生雄性大鼠的神经肌肉发育。溶剂剂量组和空白组在平面翻正和前肢握杠持续时间之间无差异性，提示染毒方式对试验结果没有影响。
本次研究结果提示中高剂量的DBP对新生雄性大鼠神经行为发育有抑制作用，但要全面了解DBP在神经行为发育方面的毒性作用，还应当进一步进行动物水迷宫、开矿实验等行为测试，并行动物学解剖，形态学观察。例如，研究发现DBP 暴露导致小鼠海马组织 CA1 病理学损伤、神经元凋亡程度增加、学习记忆下降[17]，越来越多的研究证实ERK1 /2 通路可能参与马突触可塑性的形成，调节神经突触可塑性相关的转录因子，在神经行为反应和学习记忆过程中发挥重要作用[18]，研究表明DBP可调节ERK1 /2 通路[19]，此外PAEs 作为胞外信号，可通过氧化应激途径激活 p38MAPK，介导激活下游转录因子，进而调控细胞凋亡等多种生物学功能[20]。
实际环境中DBP的污染大多是多种PAEs的混合暴露，而绝非只有一种污染物的存在，在实际防治工作中不能忽视其他污染物可能造成的毒性损伤，应做好对应的防治工作，尤其是对工作过程中会接触高浓度该类物质的工人和易受其毒性作用的婴幼儿的保护。
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项目基金：泸州市科技厅项目（（2012-S-36）（8/14））
第一作者：郝立月（1987-），研究生，助理实验师，研究方向：公共卫生与预防医学
通讯作者：刘杰，高级实验师