桑鹏 赵佳辉 王顺 杨辉
黑龙江省中医药科学院针灸脑病五科 150001
血管性痴呆( VD)是一种脑功能障碍综合征，主要症状是学习记忆能力受损。地黄汤具有治疗血管性痴呆及营养脑神经的作用。研究表明PI3K/AKT信号通路与血管性痴呆密切相关[1]， 本研究通过建立血管性痴呆小鼠模型，研究地黄汤对血管性痴呆小鼠PI3K/AKT信号通路的影响。
材料和方法
1.主要试剂和材料
18只雄性C57BL/6小鼠(6周龄，20±2g);DMEM培养液，FBS，胰酶和Dipase;兔抗AKT、p-AKT和β-肌动蛋白多克隆抗体; HRP偶联二级抗体;RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒、DCFH-DA探针、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒;膜联蛋白V/PI细胞凋亡检测试剂盒;小鼠海马HT22神经元细胞。
2.地黄汤
地黄汤:地黄15克，巴戟天15克，山茱萸15克 石斛15克，肉从蓉15克，乌头15克，远志15克，肉桂15克，五味子15克，茯苓15克，麦冬15克，菖蒲15克，薄荷10克，生姜5克，大枣5g。
3.实验动物分组、给药及标本收集
18只VD小鼠随机分为3组:1.VD组(n=6)，建立VD模型后正常喂养，并给予相应体积的生理盐水：2.Reh低剂量组(n＝6)，VD模型小鼠连续灌胃Reh(30g/kg/d)30天;3.Reh高剂量组(n=6)，VD模型小鼠连续灌胃Reh(60g/kg/d)30天。
Morris水迷宫试验后，小鼠均经颈椎脱臼处死。立即切断大脑，收集海马。取腹主动脉血清，经灭活、过滤、分包装、-80°C保存。
4.Morris水迷宫
每组小鼠在最后一次给药后进行Morris水迷宫试验。记录小鼠找到平台并站在平台表面所需的的时间(逃逸潜伏期)。每次训练间隔60秒。24小时后重复实验。
5.免疫印迹的蛋白表达检测
RIPA裂解液在冰上裂解细胞或组织20min，10000 g离心10min，将上清液蛋白转移到新的预冷EP管中。用BCA法测定蛋白质浓度后，在SDS-PAGE上分离40μg样品，转移到PVDF膜上，在室温下用含5%脱脂奶粉的PBST放置60min，然后与一级抗体（AKT、P-AKT或β-肌动蛋白的稀释比为1:1000、1:2000，1:10000）在4℃下夜间保存。第二天用PBST洗涤3次,在室温下与HRP偶联的二级抗体(1:10000)孵育60min，然后用PBST洗涤3次，加入ECL发光。在暗室中反应2-3min后，免疫印迹膜暴露、显影并固定。最后扫描胶片，数据分析。
统计分析
SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料均值±标准差表示，组间数据比较采用t检验。
结果
附图
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讨论
PIP3在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1协助下在Ser473处磷酸化AKT。可以调控各种靶基因的转录和翻译，从而调节细胞存活、增殖和凋亡。PI3K/AKT信号转导通路是拮抗细胞凋亡、促进细胞存活的经典信号转导通路[2]。本研究结果显示，地黄汤治疗1个月后， VD模型小鼠的逃避潜伏期明显缩短，而在平台所在象限的停留时间显著增加，表明地黄汤能显著提高痴呆小鼠的学习记忆能力，且高剂量Reh组疗效优于低剂量Reh组。实验证实VD模型小鼠脑组织中AKT蛋白表达明显下降，提示地黄汤可能通过调节PI3K/AKT通路，减轻海马神经元的氧化应激和细胞凋亡，从而改善脑神经的功能[3]。本研究表明，地黄汤可增强PI3K/AKT通路的活性，减少脑神经细胞凋亡，减轻氧化应激损伤，在血管性痴呆的治疗中发挥作用。
参考文献
[1] N. Munoz-Rivas, M. Mendez-Bailon, J.M. Miguel-Yanes, V. Hernandez-Barrera, J. Miguel-Diez, R. Jimenez-Garcia, and A. Lopez-de-Andres, Observational study of vascular dementia in the Spanish elderly population according to type 2 diabetes status: trends in incidence, characteristics and outcomes (2004-2013), BMJ Open
[2]Q. Wu, Y. Yang, and M.Z. Chen, Astrogalosides inhibit proliferation of hepatic stellate cells through inducing apoptosis and blocking cell cycle, Shock 21, 29-29 (2004).
[3]谢宁,史瑞,吴颂,窦金金.地黄饮子对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及大脑皮层NO、NOS含量的影响[J].中医学报,2011,26(07):821-823.