桑鹏 赵佳辉
黑龙江省中医药科学院针灸五科 150001
磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)是信号转换中生长因子及受体超家族的重要组成，可被多种细胞因子和有丝分裂原激活。激活的PI3K通过一系列中间分子激活下游蛋白激酶(蛋白激酶AKT)，调节细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡[1]。PI3K/AKT通路与血管性痴呆密切相关，研究益智地黄汤对血管性痴呆PI3K/AKT通路影响报告如下。
材料和方法
1.主要试剂和材料
20只雄性C57BL/6小鼠(6周龄，20±2g)，黑龙江省医学实验动物中心;DMEM培养液，FBS，胰酶和Dipase（购自美国 Gibco）;兔抗AKT、p-AKT和β-肌动蛋白多克隆抗体（购自美国 CST）; HRP偶联二级抗体（购自上海原生动物）RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒、DCFH-DA探针、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒（购自江苏碧云天生物科技有限公司）。
2.实验动物分组、给药及标本收集
20只VD小鼠随机分为4组:1.VD组(n=5)，建立VD模型后正常喂养，给予相应体积的生理盐水：2.多奈哌齐组(n＝5)，VD模型多奈哌齐灌胃(0.5g/kg/d)30天;3.益智地黄汤组(n=5)，VD模型灌胃(30g/kg/d)30天。4.假手术组(n=5)。分离颈动脉后缝合，正常喂养，给予相应体积的生理盐水。小鼠颈椎脱臼处死。立即切断大脑，收集海马。海马体的一部分被用来提取蛋白质，其余部分检测MDA含量、SOD活性、 Caspase- 3活性。血清的制备：取小鼠腹主动脉血清，经灭活、过滤、分包装、-80°C保存。
2.1 caspase-3活性检测
根据构建的试剂盒说明书，制备不同浓度的pNA标准品。405nm的吸光度值为A405，根据A405和pNA浓度绘制标准曲线。将脑组织匀浆移入1.5mLEP管，加入 Caspase裂解缓冲液15min，4°C10000r/min离心20min。然后再移入1.5mlEP管，加入65μl分析缓冲液，25μl裂解上层清液和10微升Ac-DEVD-pNA，96孔板37℃孵育2小时，立即检测A405值，实验组A405/对照组A405×100%作为caspase-3的相对活性单位。
2.2MDA、S0D检测
紫外分光光度法測定小鼠脑溶解液中MDA和SOD的含量。
2.3蛋白表达检测
RIPA裂解液在冰上裂解细胞或组织20min，10000 g离心10min，将上清液蛋白转移到新的预冷EP管中。用BCA法测定蛋白质浓度后，在SDS-PAGE上分离40μg样品，转移到PVDF膜上，在室温下用含5%脱脂奶粉的PBST放置60min，然后与一级抗体（AKT、P-AKT或β-肌动蛋白的稀释比为1:1000、1:2000，1:10000）在4℃下夜间保存。第二天用PBST洗涤3次,在室温下与HRP偶联的二级抗体(1:10000)孵育60min，然后用PBST洗涤3次，加入ECL发光。在暗室中反应2-3min后，免疫印迹膜暴露、显影并固定。最后扫描胶片，对数据进行分析。
统计分析
SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均值±标准差表示，组间数据比较采用t检验。
结果：
1.分光光度法显示，VD小鼠脑组织中 Caspase-3活性明显升高。予益智地黄汤后，VD模型小鼠脑组织中 Caspase-3活性显著降低。益智地黄汤组优于多奈哌齐组(图1A)。VD模型小鼠脑组织中MDA含量明显高于假手术组。益智地黄汤组脑组织中MDA含量明显降低(图1B)。益智地黄汤组脑组织中SOD酶活性明显升高(图1C)。且益智地黄汤组显著优于多奈哌齐组。
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讨论：
本研究观察益智地黄汤对PI3K/AKT信号通路影响。结果表明VD模型小鼠脑组织 Caspase-3的活性和MDA的含量明显升高，SOD酶活性明显降低。说明VD模型小鼠脑组织氧化应激和细胞凋亡明显增加，抗氧化能力下降[2]。益智地黄汤可降低VD小鼠脑组织中 Caspase-3活性，提高抗氧化能力，降低氧化应激水平。益智地黄汤通过调节PI3K/AKT通路，减轻海马神经元的氧化应激和细胞凋亡，从而改善脑神经的功能[3]。同时通过减轻神经毒性和氧化损伤，发挥益智地黄汤对血管性痴呆的保护作用与抗氧化作用。
参考文献
[1]H. Qiu, J.H. Li, S.B. Yin, J.Q. Ke, C.L. Qiu, and G.Q. Zheng, Dihuang Yinzi, a Classical Chinese Herbal Prescription, for Amyotrophic Lateral Sclerosis: A 12-Year Follow-up Case Report, Medicine (Baltimore) 95, e3324 (2016).
[2]E.Y. Jung, M.S. Lee, C.J. Ahn, S.H. Cho, H. Bae, and I. Shim, The neuroprotective effect of gugijihwang-tang on trimethyltin-induced memory dysfunction in the rat, Evid Based Complement Alternat Med 2013, 542081 (2013).
[3] E.S. Chan, D.T. Bautista, Y. Zhu, Y. You, J.T. Long, W. Li, and C. Chen, Traditional Chinese herbal medicine for vascular dementia, Cochrane Database Syst Rev 12, CD010284 (2018).