陈 玲▲ ，刘晓峰 ，廖然，殷锡虎 ，汪光枝
江西省九江市第一人民医院，南昌大学九江附属医院心血管内科，江西 九江332000
摘要：目的 探讨冠心病患者外周血T淋巴细胞免疫球蛋白样转录子3(Ig-like transcripts，ILT3)在的表达与临床意义。方法 依据临床资料将100例冠心病患者分为稳定型心绞痛（SAP）组45例，急性冠状动脉综合征（ACS）组55例。免疫磁珠阴性分选外周血的CD4+T细胞，用流式细胞术(FACS)测外周血CD4+T淋巴细胞亚群中ILT3 的表达百分比，采用实时荧光定量 PCR 检测CD4+T淋巴细胞的ILT3mRNA表达。结果 （1）用免疫磁珠阴性分选外周血的CD4+T细胞，流式细胞仪分析纯度为98.46%。(2)SAP组与ACS组比较分析,CD4+T淋巴细胞亚群中ILT3阳性率的表达百分比分别为(80.13±2.10)%和(1.83±0.91)% ，差异有统计学意义，（P＜0.05）；(3)比SAP组和ACS组外周血CD4+T淋巴细胞C 的 ILT3 mRNA相对表达量分别为(8.234±0.394)和(2.584±0.183)，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 SAP患者外周血的CD4T淋巴细胞ILT3表达明显升高,提示ILT3可能参与维持动脉粥样硬化的免疫稳态。
关键词 ：ILT3；T淋巴细胞；动脉粥样硬化；心脏病
Expression and significance of immunoglobulin-like transcript 3 in peripheral blood CD4+Tcells of coronary artery heart disease
Chen ling ▲ , Liu xiao feng, Liao ran, Yin xi hu, Wang guang zhi
Department of Cardiology, The First People’s Hospital of Jiujiang, Jiujiang Affiliated Hospital, Nanchang University, Jiujiang, Jiangxi 332000
Abstract:Objective To investigate the expression of immunoglobulin-like transcript 3 ( ILT3)in peripheral blood CD4 +T cell subset from coronary artery heart disease.Methods Selected 100 cases of patients with coronary heartdisease, 45cases of which stable angina group ( SAP),55cases acute coronary syndromes（ACS） group in all patients ,the CD4+T lymphocytes are obtained by magnetic activated cell sorting technology,ILT3-positive CD4+T cells of 100 patients were measured by flow cytometry ( FACS) and the expressions of ILT3 mRNA in CD4+T cell were determined by real-time fluorescent quantitative PCR.Results (1)CD4+T lymphocytes positive quantity was 98.46%;ILT3-positive CD4+Tcell quantity in SPA was significantly higher (80.13±2.10)%than that in ACS (1.83±0.91)% (P＜0.01)(3)The expression of ILT3 mRNA in the patients with SPA was significantly higher (8.234±0.394) than that in the patients with ACS(2.584±0.183) (P＜0.homeostasis 01)．Conclusion The high expression of ILT3in CD4+ T cell subset, may be associated with Immune homeostasis response of atherosclerosis .
Key Words:immunoglobulin-like transcript 3;T-lymphocytes; atherosclerosis;heart disease
冠心病的严重程度是由不稳定斑块决定的。有研究表明免疫失衡在斑块破裂中发挥重要作用，其中T淋巴细胞参与动脉粥样硬化相关抗原的免疫反应，致使动脉粥样斑块的发生和进展[1]。免疫球蛋白样转录子3 ( immunoglobulin-like transcript 3，ILT3) ，属于抑制性受体，可选择性表达于T淋巴细胞表面，在维持免疫稳态中发挥重要作用[2]。研究发现在ACS患者破裂斑块中和外周循环血均可检测到CD4+CD28-T细胞[3]。本研究首先分离高纯度的冠心病患者外周血CD4+T淋巴细胞；检测不同类型冠心病患者外周血的CD4淋巴细胞ILT3的表达，为探讨冠状动脉粥样硬化的免疫反应机制研究提供依据。
1 对象与方法
1.1 对象 研究对象2014年1月-2017年12月九江市第一人民心血管内科心内科住院及急诊收治的冠心病患者100例，所有患者临床诊断均符合第七版内科学关系吧分类诊断标准，依据患者病史和临床症状、心电图、心肌酶学检查结果分为：稳定性心绞痛组（SAP）45例，男25例，女20例，年龄( 61±10)岁；急性冠脉综合征组（ACS）55例 ，男43例，女12例，年龄(56±8)岁。所有患者均经冠状动脉造影检查证实。排除标准：合并急慢性感染、胶原结缔组织病、血液系统疾病、自身免疫性疾病、周围血管病、恶性肿瘤、进展期肝肾病者；服用免疫抑制剂、非甾体类炎症抑制剂等药物。本研究获得九江市第一人民医院医学伦理委员会批准，所有入选者签署知情同意书。2组间组年龄及性别无统计学差异。
1.2 方法
1.2.1 PBMC 的分离采用Ficon密度梯度离心法：所有患者在入院第２天（发病２４ｈ内）晨起抽空腹抗凝血在5ml用RPMI-16401:1培养稀释到10ml，再沿离心管壁缓慢加入约5ml淋巴细胞分离液，3000rpm×30min离心后管内分为五层，血浆和RPMI-1640液、单个核细胞(白色云雾层狭窄带)、分离液、粒细胞、红细胞。单个核细胞层包括淋巴细胞和单核细胞，此外，还含有少量血小板；用毛细滴管插到云雾层，尽量全部吸取单个核细胞(避免吸出分层液)，置入另一离心管中，然后加入5倍以上体积的RPMI-1640液，1500rpm×10min，(低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板)，洗涤细胞两次；末次离心后，弃上清，加入RPMI-1640液，重悬细胞。取30ul细胞悬液与30ul0.4%台盼蓝染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数死的细胞可被染成兰色，计算透亮的活细胞。
1.2.2 应用MACS 免疫磁珠阴性分选得CD3+T淋巴细胞：用Ficon密度梯度离心法分离获得的PBMC，用RPMI-1640缓冲液调整细胞计数。 按浓度为40ul/ 1x107ml，加入分选缓冲液（PSA、PH7.2 BSA 2 Mn EDTA）重悬，10ul/1x107ml生物素标记的“鸡尾酒抗体”(Biotin-Antibodyeoektail，包括抗CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123和血型糖蛋白A的单克隆抗体)，混匀4-80C孵育 10min。再加入30ul/1x107ml分选缓冲液和20ul/1x107ml抗生物标记的磁珠(anti-Bioth MicroBeads)，混匀，4-80C孵育 15min。 用分选缓冲液洗涤，1000r/min离心 10min，弃上清液，沉淀用5OOuL分选缓冲液重悬。 将LD柱子置于MidiMACS分选器中，3mL缓冲液过柱，然后将细胞悬液1x108ml配成1ml加入其中，重复洗三次收获从分选柱中流出的细胞。用RPMI-1640反复洗细胞两次，重悬细胞，计数。
1.2.3 用Dynabeads 阴性分选CD4+T淋巴细胞；分选柱中流出的细胞CD3+T淋巴细胞悬液计数。 用CD8阳性Dynabeads磁珠分选CD4+T淋巴细胞，每1x107ml细胞与50ul Dynabeads和1ml分选缓冲液混合，40C摇床上孵育30分钟。将上述混合液分别放入磁架中，CD4+T淋巴细胞纯化柱直至滤液完全转为清亮，CD4+T淋巴细胞以外的细胞便被扣留纯化柱中，收集到的滤液则为CD4+T淋巴细胞。用RPMI-1640反复洗细胞两次，重悬细胞，计数。将分选获得的CD4+T淋巴细胞置于含有10%胎牛血清的RPMll640完全培养液中，调整细胞浓度在lx106/m1，备用。提取的CD4+T调节性T细胞以流式细胞仪行纯度检测。
1.2.4 流式细胞术检测样品准备：上述分离纯化的CD4+细胞细胞用10%FBS RPMll640调整细胞浓度为lxl06/m,取细胞悬液100ul，分别加入6ulCD3-PerCP，6ulCD4-PE、6ulILT3-FITC抗体，混合反应后，操作同前，上流式细胞仪检测，Fse和sse选择Log方式；然后获取条件分别为CD3-PerCP，CD4-PE、CDILT3-FITC阳性。在检测前使用对照管调整FLI和FLZ的PMT，使得阴性群体位于FL1vsFLZ点图左下角。进行微调整FL2-FL1和FL1-FL2补偿；依次收集标本，收集细胞数至少5000个细胞，分析荧光强度，数据存盘，测试结束后在计算机上用cellQustPlot软件进行分析数据，计算获得细胞百分数表示。
1.2.5 总 RNA 提取与逆转录 取( 5×105) ～ 106 个CD4移入 1.5 mL 离心管中，加入1mL Trizol混匀，室温静置 5 min，加入 200 μL 三氯甲烷剧烈震荡混匀 30s后 4 ℃、12000r/min 离心15 min。吸取上清液 400μL加入等体积异丙醇，-20 ℃静置30min。4℃、12000r/min离心10 min，弃上清。用75%乙醇洗涤2次，4℃、7600r/min离心5 min后弃上清，真空离心干燥3-5 min，沉淀用0．1%DEPC 水溶解。取10μL总RNA，用M-MLV进行逆转录反应，产物 cDNA 用于实时荧光定量 PCR。
1.2.6 实时荧光定量 PCR 用Primer Premier 5． 0 软件设计合成人 ILT3和 β-肌动蛋白( β-actin) 的引物序列。加入荧光染料 SYBRGreen进行PCR反应，反应体系共20μL,包括上、下游引物( 1μmol /L) 各 2.5μL、cDNA 模板(10倍稀释) 5μL以及 SYBR Green Mix 10μL。ABI 7300荧光定量PCR仪上50℃预变性10min；60℃8min，95℃15s；60℃60min PCR条件，读板，40个循环。7300pcr仪器软件分析结果,根据CT值计算：2-△△CT计算ILT3 mRNA相对表达量
1.3 统计学分析 用 SPSS 17.0软件进行。实验数据呈正态分布，以X±S表示。组间比较采用方差分析，2组的比较用ｔ检验，采用Spearman相关性分析，Ｐ为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫磁珠阴性分选CD4+T细胞的纯度：
用免疫磁珠阴性分选CD4+T细胞流式细胞仪分析纯度为98.46%，见图1
图1：阴性分选获得的CD4+ T细胞纯度
Figure：The purity of CD4+ T cells after negative MACS separation
2.2 ILT3 在冠心病患者外周血 CD4T 细胞亚群中的表达： SAP组 CD4T 细胞亚群 ILT3 阳性细胞率为( 80.13±2.10) % ，显著高于ACS组( 1.83± 0.91 ) % ，差异有统计学意义 ( P ＜0．01) 。见图 2。
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图 2 流式细胞术检测CD4+细胞中 ILT3 表达
注: A，细胞分群示意图，R1门圈出的为CD4淋巴细胞；B,SPA组 C，ACS
2.3 稳定性心绞痛患者外周血细胞CD4的 ILT3 mRNA表达:SPA组表达量( 8.23465 ± 0.394) 显著高于ACS组( 2.584±0.183)，差异有统计学意义(P＜0.05) 。
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3 讨 论
近来研究表明，冠心病发病机制与免疫相关，尤其是以CD4+为代表的T细胞免疫失衡被认为是冠状动脉粥样硬化易损斑块发生的重要原因[4]。动脉粥样硬化动物模型的斑块检测到CD4+CD25+Ｔ细胞明显减少，CD4+T细胞亚群与动脉斑块易损性的关系是冠心病免疫机制研究的热点[5]。免疫稳态机制 (免疫耐受) 的破坏可导致针对自身抗原的自身免疫性疾病。尽管尚未将动脉粥样硬化归类于自身免疫性疾病，近年越来越多的研究关注免疫T在机体免疫耐受的产生和维持中起重要作用，参与动脉粥样硬化的发生发展中[6]，具体的机制尚不明确，进一步探讨CD4+T细胞功能具有重要的意义。本研究用免疫磁珠阴性分选成功的分离外周血，培养出纯度达98.46%CD4T淋巴细胞，为进一步的冠心病患者的免疫学研究提供就有活性的免疫细胞。
免疫球蛋白样转录物3(ILT3)作为膜受体，可表达于DC细胞和T细胞，同时具有诱导抑制 T 细胞与树突状细胞间的信号传递，抑制细胞的杀伤活性，参与细胞抗原俘获和抑制细胞的炎症免疫作用[2]。 ILT3可通过抑制ＤＣ的共刺激分子的表达，影响T细胞亚型的改变，诱导CD4+T细胞的增殖和CD4+T细胞转化为CD4+TCD25+FOXP3+的调节性Ｔ细胞[8]。探讨ILT3是否参与冠状动脉粥样斑块破裂发生和发展具有重要的意义。本研究首次观察了不同临床类型的冠心病患者外周血CD4+T细胞ILT3的表达，首先用流式细胞检测结果显示ILT3 在 CD4T 细胞亚群中的表达 SAP组 CD4T 细胞亚群 ILT3 阳性细胞率为(80.13±2.10)% ，显著高于ACS组(1.83±0.91)% ，差异有统计学意义 (P＜0.01)；同时用PCR检测SAP患者外周血CD4淋巴细胞ILT3 mRNA表达，SPA组表达量(8.234±0.394) 显著高于ACS组(2.584±0.183)，差异有统计学意义(P＜0.05) 。本研究结果显示稳定性心绞痛患者外周血T 细胞亚群CD4+细胞高表达抑制性受体 ILT3。研究表明，ACS发病机制中易损斑块形成与免疫激活密切相关，是Ｔ细胞介导的一种免疫失衡性[7][8]。通过本研究推测 ILT3 介导抑制T 细胞的炎症免疫反应，诱导调节性 CD4T 细胞的分化，进而导致血管内皮细胞的免疫抑制，参与了冠状动脉粥样硬化免疫稳态的维持。进一步的研究将体外建立淋巴细胞混合培养后（MLR）证实ILT3参与调节CD4T细胞亚型改变，抑制免疫激活的信号，从而恢复机体的正常免疫稳态。为冠心病的防治提供新的思路。
参考文献
[1].Joly AL, Seitz C, Liu S, Kuznetsov NV, et al.Alternative Splicing ofFOXP3Controls RegulatoryTCellEffector Functions and Is Associated With Human Atherosclerotic Plaque Stability.Circ Res. 2018 May 11;122(10):1385-1394.
[2].Chen L, Xu Z, Chang C, et al.Allospecific CD8 T suppressor cells induced by multiple MLC stimulation or priming in the presence of ILT3.Fc have similar gene expression profiles.Hum Immunol. 2014 Feb;75(2):190-6.
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[4].Kitamura K, Sato K, Sawabe M,et al.P-Selectin Glycoprotein Ligand-1 (PSGL-1) Expressing CD4 T Cells Contribute Plaque Instability in Acute Coronary Syndrome.[J]Circ J.2018 Jul 25;82(8):2128-2135
[5]. Forteza MJ, Polyzos KA, Baumgartner R,et al.Activation of the RegulatoryT-Cell/Indoleamine 2,3-Dioxygenase Axis Reduces Vascular Inflammation andAtherosclerosisin Hyperlipidemic Mice.Front Immunol. 2018 May 7;9:950
[6].Joly AL, Seitz C, Liu S, Kuznetsov NV,et al.Alternative Splicing ofFOXP3Controls RegulatoryT CellEffector Functions and Is Associated With Human Atherosclerotic Plaque Stability.Circ Res. 2018 May 11;122(10):1385-1394
[7].Jiang L, Chen F, Hu X, Hu Y, et al.Decreased Helios Expression in Regulatory T Cells in Acute Coronary Syndrome.Dis Markers. 2017;2017:79094
[8].Xu Z, Ho S, Chang CC, et al. ILT3.Fc inhibits the production of exosomes containing inflammatory microRNA in supernatants of alloactivated T cells.Hum Immunol. 2014 Aug;75(8):756-9.
﹡江西省自然基金项目（编号：NO.2016BAB205199）
作者简介：陈玲（1969-）女，医学博士，主任医师，主要从事冠心病的基础和临床研究
▲ 通信作者：陈玲 chenling0792@163.com