刘卫1 汪松2
1吉林省中医药科学院 吉林长春 130000 ；2吉林省妇幼保健院 吉林长春 130000
摘要：目的 建立地黄药材中地黄苷D含量的高效液相色谱法。方法 地黄苷D采用超声提取，色谱柱为Diamonsil；检测波长：203nm；柱温：35℃；流速：0.8 ml/分钟；流动相：乙腈-0.1%磷酸（5:95）。
结果 地黄苷D线性范围17.14～428.5μg /ml，线性方程y=3769X-13682，相关系数r=0.9998；平均回收率100.02%, 相对标准偏差0.007%(n =6)。不同产地的17批地黄药材中地黄苷D的含量为0.157%～0.547%。
关键词 不同产地；地黄；地黄苷D；反相高效液相色谱法。
地黄为玄参科植物地黄Ｒehmannia glutinosa Libosch．的新鲜或干燥块根，味甘、寒，具有清热凉血，养阴生津的功效，用于热入营血，温毒发斑，吐血衄血等。地黄，始载于《神农本草经》，称为干地黄，列为上品，其后代本草均有收载。主产于中国河南、河北、内蒙古及东北等地。地黄的化学成分以甙类为主，其中又以环烯醚萜甙类为主。成分为梓醇、二氢梓醇、地黄苷A、B、C、D 等；苯乙醇苷类成分为毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷等，采用高效液相色谱法（HPLC）建立了地黄中地黄苷D的含量测定方法。依据方法学的研究要求，开展了地黄苷D HPLC含量测定的方法耐用性研究。
方法的耐用性系指测定条件发生微小变动时，测定结果保持不受影响的承受程度，考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力。HPLC 检测方法的耐用性考察因素包括不同品牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速、pH 值和流动相的组成等。本文采用单因素法，考察了不同品牌及规格的色谱柱、柱温、流速、流动相比例和pH 值等对分离度、理论板数的影响。
1 材料与方法
1.1仪器、试剂与样品
LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SPD-20A紫外检测器；UV-1810 型紫外分光光度计购于北京普析通用仪器有限责任公司；BT.125D型电子分析天平购于德国赛多利斯公司； KQ-250型超声波清洗机购于昆山市超声仪器有限公司。
1.2药品与试剂
地黄苷D对照品购于成都曼思特生物科技有限公司；其他不同产地药材为市售；乙腈（色谱级，Fisher Co.Ltd）；水：娃哈哈饮用纯净水；甲醇、乙醇（分析纯），北京化工厂。
1.3 方法
1.3.1 地黄苷D对照品的制备 取地黄苷D对照品适量，精密称定，加25%甲醇制成每1ml含0.132mg的溶液，即得。
1.3.2 供试品溶液的制备 取本品切成约5mm的小块，经80℃减压干燥24小时后，研成粗粉，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇25ml，称定重量，超声处理1小时，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，高速离心10分钟，取上清液滤过，取续滤液，即得。
1.3.3 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18（150 mm×4.6mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸（5：95），柱温35℃，流速0.8mL/分钟，检测波长为203nm，进样体积为10μL。采取单因素法分别考察色谱柱（Agilene 5 TC- C18 5μm，250×1.6mm，WondaSil C18 5μm，250×1.6mm和Diamonsil C18 5μm，250×1.6mm；）、柱温（30℃、35℃和40℃）、流速（0.8 mL/分钟、1 mL/分钟和1.2 mL/分钟）、流动相组成（甲醇-0.1%磷酸和乙腈-0.1%磷酸）和pH值（0.05%磷酸、0.1%磷酸和0.15%磷酸）等因素对系统适用性的影响。
2 结果
2.1 流动相溶剂
Diamonsil C18色谱柱，分别以甲醇-0.1%磷酸溶液（5-95）、乙腈-0.1%磷酸溶液（5-95）为流动相；流速为每分钟1ml；检测波长为203nm；柱温30℃。将对照品溶液、供试品溶液进样，记录色谱峰，结果乙腈-0.1%磷酸溶液（5-95）分离效果较好。
2.2 色谱柱 分别用Agilene 5 TC- C18 5μm，250×1.6mm； Diamonsil C18 5μm，250×1.6mm；WondaSil C18 5μm，250×1.6mm；在上述色谱条件下，将对照品溶液、供试品溶液进样，记录色谱峰，结果Diamonsil色谱柱分离效果更好一些，所得图谱的峰面积的响应值较高、峰的个数较稳定，保持一致，故定为选定Diamonsil色谱柱。
2.3 柱温 在上述色谱条件下，将对照品溶液、供试品溶液进样，记录色谱峰，柱温发生变化（30℃、35℃、40℃），其他条件不变化时，地黄药材中地黄苷D分离检测结果表示，35℃柱温时样品中地黄苷D的分离效果较好。
2.3 流速 将供试品溶液进样，记录色谱峰，流动相速度为（0.8 mL、1 mL、1.2 mL/分钟），其他条件不变时，样品中地黄苷D的检测结果表明，流速0.8 mL/分钟时，地黄苷D分离效果较好。
2.4 PH值 将供试品溶液进样，记录色谱峰，流动相中水相的磷酸浓度（PH）发生变化（0.05%磷酸、0.1%磷酸、0.15%磷酸），其他条件不变化时，地黄药材中地黄苷D分离检测结果表示，磷酸浓度0.1%磷酸，地黄苷D分离效果较好。
3 方法学考察
3.1 线性关系考察
精密称取地黄苷D标准品17.14mg，用25%甲醇溶解并定容为10ml，分别移取地黄苷D溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5ml，分别定容于10ml 容量瓶中，求出峰面积平均值。y=3769X-13682，相关系数r=0.9998。结果表明，地黄苷D在17.14～428.5μg /ml 范围内，地黄苷D浓度与峰面积呈良好线性关系。
3.2 精密度实验
取对照品溶液，重复进样6次，测其峰面积，计算 RSD值，RSD值0.476%。
3.3 稳定性试验
取同一供试品溶液，常温放置，24小时内每隔一定时间，记录其峰面积积分值，结果表明供试品溶液在24小时内基本稳定, RSD值0.909%。
3.4重复性试验
取同一批地黄药材6份，依法独立测定6次，变异系数表明重复性良好,RSD值0.013%。
3.5 准确度试验
将一定量的标准品加入已测知含量的样品中，再按样品分析相同的方法进行测定，平行测定6次， RSD值0.007%。
3.6 不同产地地黄样品中地黄苷D含量
按样品提取方法提取后, 在上述条件下测定，不同产地的17批地黄药材中地黄苷D的含量为0.157%～0.547%。
4 讨论
4.1流动相选择
地黄中的成分复杂，用最常用的甲醇-磷酸、乙腈-磷酸等流动相系统，基于2020年版《中国药典》（一部）地黄药材的含量测定所用流动相，即甲醇-0.1％磷酸溶液，但分离效果不理想，本文采用乙腈-0.1%磷酸为流动相，分离效果好，最后确定了本文中的流动相系统。该流动相系统既缩短了样品测定时间，又不会影响待测物峰形，可快速而高效地测定地黄中地黄苷D的含量。
参考文献：
1 中国药典一部，2020:129
2 李更生 王惠森. HPCE法测定地黄中地黄苷D的含量.中草药，2003 , 34(8):752-754
3 刘明, 李更生, 王慧森 7 种地黄丸中地黄苷D 的含量测定.中国医院药学杂志，2008,28（13）:1130-1131