石继伟①，姚婷②，张慧杰②，陈敏②
镇江市食品药品监督检验中心①，江苏大学附属医院②，镇江，212004
摘要 目的：采用HPLC-DAD快速有效地测定患者血浆中亚胺培南的浓度，为感染性休克患者调整剂量提供依据。方法：前处理采用6%高氯酸-乙腈（1:1）沉淀萃取，采用 OMNI Zinger C18色谱柱；柱温：30℃，流动相：甲醇-10mmol/L磷酸二氢钾溶液（5:95），流速：1.0mL/min，检测波长：295nm，进样量：20 μL；二极管阵列检测。内标法定量，5-溴脲嘧啶为内标。 结果：亚胺培南在 0.5～100mg/L内线性关系良好，r=0.9996，定量限为0.5mg/L；相对回收率为88.17～94.22%，绝对回收率为78.35～85.27%；日内和日间RSD均<10%。结论：本方法准确、简便，符合亚胺培南药物浓度监测的要求，可用于调整患者的用药剂量。
关键词 亚胺培南；血浆；血药浓度；高效液相色谱法；感染性休克
亚胺培南为碳青霉稀类光谱抗菌药物，对β-内酰胺酶稳定，临床用于耐β-内酰胺类的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的感染[1]，目前已成为重症感染最主要的药物之一。作为时间依赖性抗菌药，其最佳抗菌活性要在2次给药间隔40%（40%T＞MIC），而对于重症感染和多重耐药菌感染时甚至要达到100%以上[2]。但大剂量治疗严重感染时，容易引起耐药性，还易引起惊厥、意识障碍等严重中枢神经系统不良反应[3]。感染性休克患者，因严重感染或伴有肾功能衰竭，其体内药物分布和半衰期等药代动力学参数因病理因素发生改变，血药浓度更加难以预测[4]。因此，在临床中有必要对亚胺培南的血药浓度进行监测，以确保其安全有效。
亚胺培南的检测方案国内外文献报道较少，主要采用HPLC-MS和HPLC法[5-6]。HPLC-MS法仪器成本较高，难以普及。故本实验采用HPLC法，对本科室感染性休克患者血药浓度进行监测，为及时调整个性化给药方案提供依据。
1 材料与方法
1.1仪器、对照品和试剂
1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），BP211D电子分析天平（德国赛多利斯公司），NU超纯水系统（南京优普公司），高速冷冻离心机（美国贝克曼公司），涡旋混匀器（美国S1公司）
亚胺培南对照品购自美国Aladdin公司，纯度≥98.0%;内标物：5-溴脲嘧啶(Sigma公司纯度≥99.0%；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；尿素、高氯酸、磷酸二氢钾、二氯甲烷等均为分析纯，购自国药集团。
1.2溶液配制
1.2.1 对照品溶液 精密称取亚胺培南对照品适量，用稳定剂（3%尿素）配成浓度为1g/L的储备液。用稳定剂稀释，配制成浓度为5、10、20、50、100、200、500、1000mg/L的系列对照品溶液。
1.2.2 内标溶液的配制 精密称取5-溴脲嘧啶适量，用水稀释成浓度为500mg/L的内标溶液。
2 方法与结果
2.1色谱条件 采用OMNI Zinger C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；柱温：30℃，进样量：20μL，流动相：甲醇-10mmol/L磷酸二氢钾溶液（用三乙胺调pH到6）（5:95），流速：1.0mL/min，检测波长：295nm。血浆中内源性杂志均不影响亚胺培南与内标物的分离，亚胺培南的保留时间约为6.40min，内标物的保留时间约为9.81min，结果见图1
1为亚胺培南，2为内标
2.2样本前处理 精密吸取血浆样品180μL，置1.5mL EP管中，加入浓度为 500 mg/L的5-溴脲嘧啶20μL，加入6%高氯酸-乙腈（1:1）200μL，涡旋震荡30s，静置10min，13000r/min离心20min，吸取上清液400μL于1.5mL EP管中，加入二氯甲烷 500μL，涡旋1min，13000r/min离心10min，吸取上清液 20μL进样。
2.4 标准曲线与定量限 精密吸取不同浓度的系列对照品溶液各20μL 与180μL空白血浆混合，使亚胺培南的浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 mg/L，按“2.1”项下色谱条件进样，以亚胺培南的峰面积(As)与内标峰面积(Ai)之比(Y)对亚胺培南浓度(X)进行回归，得到回归方程Y=0.0157X+ 0.0023，r=0.9996。结果表明，亚胺培南在0.5~100 mg/L范围内线性关系良好，标准曲线的最小浓度0.5mg/L设为定量限。
2.5 精密度试验 取空白血浆，分别配制浓度为0.5,1,10,50,100的样品各5份，按“2.1”项下方法进样，连续测定5次计算日内精密度；连续测定5d，计算日间精密度。结果见表1。
2.6 回收率试验 取“2.5”项下的溶液，加入相应浓度的亚胺培南对照品和内标物质溶液，不经沉淀，直接进样，计算绝对回收率。另取“2.5”项下的溶液，按“2.2”项下的方法处理后进样，计算相对回收率。结果见表1。
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2.7稳定性试验 取空白血浆，配制浓度为50mg/L的标准品5份，经“2.2”项下处理后，在室温下分别放置 4、24、48 h，分别进样测定，计算变异系数（CV%）；将配制好的样本，置于4℃保存，分别1周和1个月后复测3次，计算CV%。结果显示，亚胺培南稳定性良好，CV%均＜10%。
3 临床应用
选自2020年10月以来本科室6例感染性休克患者，采用本方法测定患者血浆中亚胺培南浓度，样本取连续给药4剂后、用药前 0~30 min患者的血浆，测定谷浓度，结果见表2。
经验性治疗患者，亚胺培南以谷浓度1mg/L为临床有效和安全指标范围。根据测定结果调整治疗方案：（1）谷浓度≤1 mg/L，增加给药频次、增加给药剂量或延长滴注时间；（2）1 mg/L＜谷浓度≤8mg/L，维持原给药方案；（3）谷浓度＞8 mg/L，减少给药频次，或减少给药剂量。
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结果表明，6例患者中需要增加血药浓度2例，需要减少血药浓度1例。同样也看出，患者血浆中亚胺培南的浓度有较大的个体差异，因此对其进行监测非常重要。
4 讨论
4.1处理方法的选择
样本处理方法直接影响HPLC法的分离效果，常用的处理方法有固相萃取法和直接沉淀法。本研究对比了两种处理方法的差异，结果显示，两种处理方法没有显著性差异。因此选用了更简便、省时、省事的直接沉淀法。
沉淀提取剂的选择也直接影响测量结果，本研究选用了甲醇、三氯甲烷、乙腈、6%高氯酸和乙腈的各种比例。综合沉淀反应速度、分离度、回收率等因素，最终选用了6%高氯酸-乙腈（1:1）作为沉淀提取剂。其反应时间适中，静置10min后离心效果佳，分离度好，回收率最高。
本研究试验了多种内标，如帕尼培南、美罗培南、异烟肼、氟脲嘧啶、5-溴脲嘧啶、甲硝唑等。经过综合比对，5-溴脲嘧啶和亚胺培南的分离度最好，且不受血浆中内源性杂质的干扰，故选用5-溴脲嘧啶做为内标。
4.2 临床应用
本方法样本处理简单，准确，灵敏，重复性好，可用于感染性休克患者亚胺培南血药浓度的快速监测，可以为个体化给药方案的制定提供了技术检测依据。但限于时间短、样本量有限，研究深度不足。对于如何指导临床调整用药方案，以及对感染性休克患者病情的恢复、并发症的减少、住院时间和费用的减少、满意度提高等方面还需要进一步的研究和探寻。
参考资料：
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