付若曦
成都外国语学校，四川省成都市 611731
摘 要: 肺癌的高发病率及高死亡率使得其受到高度重视。非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的肺癌类型，约占所有肺癌诊断的80%。然而，目前临床医学指南对于IA-IIIA期可手术患者的治疗方案的选择、疗效评价以及复发检测尚无定论。随着基因技术和二代测序技术的不断发展，人们逐渐意识到了驱动基因突变在癌症治疗中的重要性。广泛的肿瘤内体细胞拷贝数变化和突变的异质性指出，EGFR、MET、TP53等基因的驱动突变几乎都是克隆性的。NSCLC的发展涉及多种基因异常，导致支气管上皮细胞恶性转化，随后侵犯、淋巴结和远处转移。在这些基因异常中，TP53抑癌基因是最常见的靶点，所以TP53的异常在肺上皮细胞的肿瘤发生中起着重要作用。近年来，循环肿瘤DNA (ctDNA)已成为一种特异性和敏感性的血液生物标志物，用于检测基因突变，并评估治疗疗效。本文就利用DNA深度测序技术，探讨NSCLC患者中TP53的驱动基因突变；同时讨论ctDNA在评估NSCLC患者疗效中的作用。
关键词: NSCLC疗效评估；ctDNA；TP53；DNA深度测序技术；驱动基因突变
引言
在全球范围内，肺癌是癌症相关死亡的主要原因之一，其中NSCLC是最常见的肺癌类型。由于NSCLC术后的高复发率，及时监测并干预对其治疗十分重要。本文旨在从TP53驱动基因突变，DNA深度测序技术及ctDNA应用几方面探究ctDNA在评估患者疗效中的作用。
1. ctDNA的介绍及应用
已有研究提示：肿瘤细胞会把自身的DNA（ctDNA）释放到血液循环中，因此检测肿瘤患者术后外周血中是否存在ctDNA，可以有效实时地检测肿瘤复发。一个细胞死亡后，会将内容物释放到血液中，形成残留在血液中的降解DNA片段，称作循环游离DNA（cfDNA），cfDNA在两天左右会被肾脏代谢。同理，正在死亡的癌细胞释放入血液的DNA，称作循环肿瘤DNA（ctDNA）。在分子视角下，用切除的肿瘤原发病灶的DNA作为参照物，通过DNA深度测序技术，可区分血液中游离的DNA片段为cfDNA还是ctDNA。（如图1）
大约16%的肺癌病例适合进行手术切除，但在切除的病例中，大约30-70%的患者会复发致命疾病。更好的肿瘤复发预测指标可以改善复发患者的治疗结果，同时避免其他不必要的手术。2017年，Abbosh等人的研究使用了患者特异性多重PCR来检测血浆携带的肿瘤来源的细胞游离DNA(替代循环肿瘤DNA，ctDNA)作为预测生物标志物post-resection肿瘤复发的早期非小细胞肺癌患者 [1]。该团队使用肿瘤特异性的系统发生方法来描述前100名TRACERx(通过治疗跟踪非小细胞肺癌演变(Rx))研究参与者的ctDNA，其中包括一名也被招募到PEACE(晚期癌症环境的死后评估)后研究的患者。他们鉴定了ctDNA释放的独立预测因子，并分析了肿瘤体积检测极限。通过术后血浆的盲测，观察到辅助化疗耐药的证据，并识别出肺癌很可能复发的患者。最后，Abbosh团队发现系统发育ctDNA图谱追踪肺癌复发和转移的亚克隆性质，为ctDNA驱动的治疗研究提供了一种新的方法
2. NSCLC可行性治疗方案
NSCLC患者可通过胸部CT、PET扫描、脑部MRI进行评估以确定疾病的表现阶段，从而确定治疗方案。根据NCCN临床医学指南，I-II期患者通常采用切除肿瘤，高风险患者可使用辅助化疗；局部晚期（III期）患者采用联合治疗，即结合新辅助化疗、IIIA期切除或放疗。若发现癌细胞转移，治疗已为时过晚，只能是姑息性的。IA-IIIA期可手术患者的治疗方案的选择、疗效评价以及复发检测目前尚无定论。
2.1 可行性方案
治疗方案的选择采用对基因突变的分析（二代测序技术分析驱动基因的突变），从而结合基因大数据和临床数据，设置特定的治疗方案。对于疗效评估，可手术患者术后肿瘤切除后，采用DNA深度测序技术追踪血液中的ctDNA的含量以评估患者是否有微小残留病灶，患者治疗受益情况。可手术患者复发时大多数属于全身性多位点复发，例如肝转移、骨转移，因此无法再次进行手术切除，再次治疗已经为时过晚。知晓体内微小残留病灶生长情况能够提前预警并及早干预，以延长患者的生存期。
疗效评估的实验方法：
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在治疗结束的血液DNA测序中，若与术前血液DNA测序相比，ctDNA含量下降，即可得知治疗有效；若ctDNA含量上升，则需立即更换治疗方案，并持续监测血液中ctDNA含量变化情况。
3. DNA深度测序技术
DNA测序是确定核酸序列的过程，即DNA中核苷酸的顺序。它包括用于确定腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶这四个碱基顺序的任何方法或技术。DNA测序方法的出现大大加快了生物和医学的研究和发现。DNA深度测序是指对一个基因组区域进行多次测序，有时是数百次甚至数千次。第一批DNA序列是在20世纪70年代早期由学术研究人员通过基于二维色谱的费力方法获得的。随着基于荧光的测序方法和DNA测序器的发展，DNA测序变得更加容易，而且速度更快 [2]。
3.1 DNA聚合酶链式反应（PCR）
DNA可以通过一种化学程序进行测序，即在碱基的每次重复时部分地打破末端标记的DNA分子。标记片段的长度，然后确定该碱基的位置。Maxam等人描述了优先在鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶上裂解DNA的反应，以及在胞嘧啶上裂解DNA的反应。当这四种反应的产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的大小来确定时，DNA序列可以从放射性条带的模式中读出。该技术将允许从标记的角度测序至少100个碱基 [3]。
3.2 第一代测序技术
第一代测序技术出现于20世纪70年代，其中包括由美国分子生物学家Allan M. Maxam和Walter Gilbert发现并命名的Maxam-Gilbert法，以及由英国生化学家Frederick Sanger发现的Sanger法(或双脱氧法)。桑格法是两种方法中更常用的一种，它在模板链上合成DNA链，但当四种可能的双脱氧核苷酸中的一种(缺少3’羟基)被合并时，链的生长就停止了，从而阻止了另一种核苷酸的添加。一群嵌套的，截断的DNA分子被制造出来，它们代表了模板DNA中特定核苷酸的每个位点。这些分子在电泳过程中根据大小被分离，由此推断出的核苷酸序列是由计算机推断出来的。随后，该方法通过自动测序机进行，用荧光标记的截断DNA分子在薄玻璃毛细管内按大小分离，并用激光激发检测。第一代测序技术的测序读长可达1,000bp，其中准确性高达99.99%，但由于其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
3.3 第二代测序技术
基于第一代测序技术的种种缺点，经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa/HiSeq技术和ABI公司的SOLID技术为标记的第二代测序技术诞生了。传统和第二代测序的工作流程为：(a)通过高通量散弹枪Sanger测序，将基因组DNA片段，然后克隆到质粒载体上用来转化大肠杆菌对于每个测序反应，一个细菌菌落被挑选和质粒DNA分离。每个循环测序反应在一个微体积内进行，产生一个终止ddntp的阶梯状染料标记产品，这些产品在测序仪器的一次运行中在96或384个毛细管中的一个毛细管内进行高分辨率电泳分离。当荧光标记的离散大小的片段通过探测器，四通道发射光谱用于生成序列跟踪。(b)在使用循环阵列方法的散弹枪测序中，共同的适配器连接到片段基因组DNA，然后经过几种方案中的一种，结果是数百万个空间固定的PCR菌落或“polonies” 的阵列15。每个polony由单个猎枪库片段的许多副本组成。由于所有的polpolies都被固定在一个平面阵列上，一个微尺度的试剂体积(例如，用于引物杂交，然后用于酶延伸反应)可以应用于并行操作所有阵列特征。类似地，基于成像的荧光标记检测与每个扩展可用于并行获得所有特征的测序数据。连续迭代的酶询问和成像用于建立一个连续的测序读取阵列的每个特征[4]。
4. TP53在肝癌中的基因突变
4.1 基因突变的原理
基因突变指由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换，而引起的基因结构的改变。碱基对的置换包括同义突变、错义突变和无义突变。碱基对的置换中，同义突变，如TTA→UUA经突变后，TTG→UUG，虽然DNA或RNA产生了不同的单碱基置换，但不影响蛋白质的功能，因为此2条密码子对应的是一种氨基酸，唯一影响的就是采用不同tRNA去携带同样氨基酸，因而翻译在此处通过的时间不同。在不同人群中，这种良性突变常有存在，这是导致人的相貌千差万别的原因之一。该现象称之为单核苷酸多态性（SNP）。错义突变，如CCU经突变后变为CUU，从而导致产生蛋白在该此处的氨基酸改变，进而导致空间结构发生重大变化，致使癌变的概率增加。无义突变，如UCG经突变后变化为UAG，即终止密码子，则蛋白质翻译提前终止，对蛋白质产生毁灭性破坏，癌变风险大大增强。
4.2 TP53基因突变
TP53肿瘤抑制蛋白在细胞周期和细胞死亡的调控中起着关键作用，同时也参与细胞分化、DNA修复、衰老和血管生成。作为一种肿瘤抑制基因，TP53在癌症中常发生突变。TP53基因异常是肺癌中最重要的事件之一，在肺上皮细胞的肿瘤发生中起着重要作用。TP53功能失活或其伴随途径的失活是人类肿瘤的一个共同特征，通常与恶性肿瘤增加、患者生存率差和治疗耐药性相关[5]。大多数临床研究表明，具有TP53基因突变的非小细胞肺癌预后较差，可能具有对化疗和放疗相对较高的耐药性。深入了解TP53在肺癌发生中的作用，可能会导致更合理的靶向临床方法，从而提高肺癌患者的生存率。各种类型的细胞压力，如由紫外线和癌基因激活引起的DNA损伤，会导致TP53的稳定和激活，从而使蛋白质在细胞核内积累。TP53通路被这种改变正常细胞周期进程的细胞压力激活，或可诱导基因组突变，导致正常细胞转化为癌细胞 [6]。
展望
对于癌症的治疗，ctDNA在疗效评估、复发检测以及在NSCLS患者中针对TP53基因突变的治疗方案的选择都是可行的。
参考文献
[1] Abbosh C, Birkbak N J, Wilson G A, et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution[J]. Nature, 2017, 545(7655): 446-451.
[2] Pettersson E, Lundeberg J, Ahmadian A. Generations of sequencing technologies[J]. Genomics, 2009, 93(2): 105-111.
[3] Maxam A M, Gilbert W. A new method for sequencing DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1977, 74(2): 560-564.
[4] Shendure J, Ji H. Next-generation DNA sequencing[J]. Nature biotechnology, 2008, 26(10): 1135-1145.
[5] Sionov R V, Hayon I L, Haupt Y. The regulation of p53 growth suppression[J]. Cell cycle checkpoints and cancer. Landes Bioscience, Austin, 2001: 106-25.
[6] Mogi A, Kuwano H. TP53 mutations in nonsmall cell lung cancer[J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2011, 2011.