崔相玉
赤峰市妇幼保健院检验科 内蒙古 赤峰 024000
摘要：目的:探讨无创产前检测技术（non-invasive prenatal testing，NIPT）在单胎妊娠孕妇染色体非整倍体异常检测的应用价值。方法:收集2017~2020年在赤峰市妇幼保健院产前诊断中心进行无创产前检测的7922例孕妇，提取孕妇血浆中的胎儿游离DNA后进行高通量测序。对NIPT检测提示染色体异常者，进行羊膜腔穿刺检验结果真假，并将各年龄段的孕妇进行统计比较，得出三体染色体异常比例最高的年龄段。结果:7922例孕妇NIPT筛查结果检测为染色体异常共计33例，检出率为0.416%。其中T21-三体高风险共计22例（0.278%，1例假阳性）、T18-三体高风险共计10例（0.126%，4例假阳性）和T13-三体高风险共计1例（0.013%）。本文将20-24岁、25-29岁、30-34岁、35-39岁和≥40岁年龄段的孕妇进行统计比较，发现年龄≥40岁的孕妇患有三体异常比例最高（4.04%，8/198）。结论:T21-三体综合征阳性率远高于T18-三体综合症和T13-三体综合征，高龄孕妇（≥40岁）出现三体异常综合征可能性较大，NIPT产前检测对高龄孕妇有较好的筛选应用价值，对于高龄孕妇可以进行适当的推广应用。
关键词：无创产前检测；染色体非整倍体；胎儿游离DNA；高龄孕妇[作者简介：崔相玉（1991年11月—），女，内蒙古赤峰市松山区，大学本科，初级检测师，主要研究方向为深度基因测序。]
中国是儿童出生缺陷发病率较高的国家，据统计中国每年约有1600万的新生儿，而先天性致愚致残缺陷儿占出生儿童总数的4%-6%，总数高达120万，其数量约占全世界每年500多万出生缺陷儿童的五分之一[1]。中国政府每年需支付大量的经费用于唐氏综合征患儿的医疗救治，即使经过救治存活下来的婴儿多为终生残疾或智力存在障碍[2]。由此带给社会较为严重的经济负担，其次对患者家庭造成的心理负担和精神痛苦更是无法用金钱来衡量。1997年卢煜明教授在工作中发现，母体血液中存在着胎儿的游离DNA（cell-free DNA）[3]。并开创了利用游离DNA作为检测唐氏综合症的新方法，并在全球多个国家得到了应用。无创产前检测指的是对胎儿进行21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征常见染色体非整倍体的筛查，不包括其他染色体非整倍体筛查。经过多年的临床实验研究表明NIPT是目前最有效的胎儿非整倍体筛查的方法[4-5]，其中NIPT筛查是以胎盘游离DNA作为检测指标的产前筛查法。在赤峰地区常规筛查手段是血清学标志物检测及彩超检查，但血清学标志物检出率为60%~85%，并且存在5%的假阳性，较大程度影响其检测精度[6]。利用孕妇外周血胎儿游离DNA进行NIPT筛查，在21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征染色体异常检测中敏感性、特异性均优于常规血清学检测[7]。 本研究通过分析2017~2020年在赤峰市妇幼保健院进行无创产前检测的7922例孕妇情况，根据结果探讨NIPT检测在胎儿染色体非整倍体产前筛查的应用价值。
1对象和方法
1.1对象
回顾2017年4月26日至2020年12月16日，内蒙古赤峰市内的11个旗县区在赤峰市妇幼保健院进行NIPT检测的7922例孕妇的临床资料。孕妇年龄范围为20~58岁，孕妇及家属知情自愿要求行NIPT检测。排除标准：①孕周＜12+0周；②夫妇一方有明确染色体异常；[]③孕妇接受过移植手术、1年内接受过异体输血、干细胞治疗、4周内接受过引入外源DNA的细胞免疫治疗等；④有基因遗传病家族史或提示胎儿罹患基因病高风险；⑤胎儿超声检查提示有结构异常须进行产前诊断；⑥孕期合并恶性肿瘤（但良性子宫肌瘤除外）；⑦三胎及以上妊娠。
1.2无创产前检测
1. 2. 1仪器
检测仪器使用二代基因测序仪BGISEQ-500（华大生物科技武汉有限公司），采用大规模平行测序。试剂使用核酸提取试剂（华大基因）、胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）、测序反应通用试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）、高灵敏度荧光染料DNA检测试剂盒（invitrogen）。
1. 2. 2标本采集及处理
①标本采集时使用实验室指定采血管，用采血管收集孕妇外周血5ml，样本采集过程应严格执行无菌操作。通过两步离心法实现血浆的分离，具体步骤如下:将全血样本置于室温下，开启高速冷冻离心机，使机内温度降到4℃；在该温度条件下以1600×g离心10min。离心结束后将上清（血浆）平均分装到两个置于冰盒上的2.0mL离心管中。将上一步分离好的血浆置于离心机内，4℃条件下以1600×g离心10min，以去除残余细胞，离心结束后于冰盒上将上清转入新的2.0mL离心管中，吸取时不能吸到管底残余的细胞，分离结束后管底应有50-100μL血浆量剩余。将分离好的血浆按分血顺序分别装进独立的冻存盒，并将冻存盒保存于-80℃低温冰箱。②应用磁珠分离法提取样品DNA。③严格按照“胎儿染色体非整倍体T21－三体、T18－三体和T13－三体检测试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)说明书”(华大生物科技武汉有限公司)操作，构建DNA文库，并对文库进行质量检测，最后上机测序。
2 结果
7922例孕妇NIPT筛查结果提示染色体异常共计33例，检出率为0.42%（33/7922）。其中T21-三体高风险共计22例（0.28%）、T18-三体高风险共计10例（0.13%）和T13-三体高风险共计1例（0.01%）。33例孕妇在知情同意下行介入性产前诊断，羊膜腔穿刺分析确诊T21-三体21例、T18-三体6例及T13-三体1例。T21-三体假阳性1例，T18-三体假阳性4例。T21-三体阳性检出率为95.4%（21/22），T18-三体阳性检出率为60.00（6/10），T13-三体阳性检出率为100.00（1/1）。从结果中发现T21-三体综合征阳性率远高于T18-三体综合症和T13-三体综合征。
本文将20-24岁、25-29岁、30-34岁、35-39岁和≥40岁年龄段的孕妇进行统计比较，结果发现20-24岁年龄组孕妇三体综合征检出率为0.12（1/860），25-29岁年龄组孕妇三体综合征检出率为0.12%（3/2457），30-34岁年龄组孕妇三体综合征检出率为0.22%（6/2705），35-39岁年龄组孕妇三体综合征检出率为0.88%（15/1702），年龄≥40岁的孕妇三体综合征检出率为4.04%（8/198）（表1）。从结果中发现高龄孕妇（≥40岁）出现三体异常综合征可能性较大。
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3 讨论
中国每年约有1600万的新生儿，而先天性致愚致残缺陷儿占出生儿童总数的4%-6%，总数高达120万[8]，染色体数目异常主要包括T21-三体、T18-三体、T13-三体、克氏综合征和特纳综合征等，其比例约为产前遗传性疾病的80%～95%[9]，其中以T21-三体综合征最为常见，Lo et al. (1999)研究表明，新生儿中T21-三体综合征发生率高达1/800，其次是T18-三体和T13-三体综合征[10]。大量研究表明(曹旭 et al., 2019; 韩美艳 et al., 2019; 刘春林、陈培松、何小洪、余学高、黄浩、黄彬、梁楚嘉, 2020; 王雯 et al., 2019)(曹旭 et al., 2019; 韩美艳 et al., 2019; 刘春林、陈培松、何小洪、余学高、黄浩、黄彬、梁楚嘉, 2020; 王雯 et al., 2019)，高龄孕妇不仅存在新生儿出生缺陷风险，也存在妊娠期并发症高风险[11-12]。其根本原因是与我国二孩政策放开，高龄孕妇比例增加有关。Chan et al. (2020)对中国地区的189809份NIPT样本进行了研究发现，其中在母亲年龄为39岁及以上时T21-三体和T18-三体综合征的发生率风险明显增加，并建议将NIPT检测的年龄界限提高到39岁及以上[13]。高龄已经成为染色体非整倍体异常形成的独立高危因素[14]。在本文的研究中，7922例孕妇中其中≥40岁的孕妇共198例，而198例孕妇中共检出染色体异常8例，其染色体异常阳性率为4.04%（8/198），而＜40岁孕妇染色体异常阳性率仅为0.32%（25/7724）。由此可见≥40岁高龄孕妇染色体异常发病率较高，建议将NIPT检测的年龄界限提高到40岁及以上。预产年龄≥40岁的孕妇比例逐年增加，对于高龄孕妇通过合理、必要的产前诊断排查胎儿染色体疾病具有非常重要的临床意义和社会意义。但NIPT检测结果同样存在假阳性和假阴性的风险。张卫华 et al. (2018)等经研究表明NIPT检测对T21-三体、T18-三体和T13-三体假阳性率为0.17%。当NIPT检测的结果为低风险，并不排除T21-三体、18-三体和T13-三体综合征以外的其他染色体不存在异常的风险。
本研究结果显示：孕妇中T21-三体综合征阳性率远高于T18-三体综合症和T13-三体综合征。NIPT技术对于≥40岁高龄孕妇有较好的筛查价值，用于初筛十分适宜，对于高龄孕妇可以进行适当的推广应用。NIPT筛查结果依然存在假阳性的可能性，当检测结果提示为高风险时，仍需进行介入性产前诊断，避免假阳性的事件发生。
参考文献
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[14]曹旭, 宋辉, 王清枚, et al., 2019. 无创DNA检测结果为高风险孕妇的产前诊断结果及妊娠结局分析. 蚌埠医学院学报 44, 70-72.
作者简介：崔相玉（1991年11月—），女，内蒙古赤峰市松山区，大学本科，初级检测师，主要研究方向为深度基因测序。