赖秋玲
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摘要：近年来，单克隆抗体是生物制药领域研究和发展最快的领域之一，单克隆抗体具有地耐药性、高效性、专一性等多种优越特性而受到各界关注，随着单克隆抗体制备技术的不断出现，对其稳定性和亲和力提出了更高的要求，本项目从全人源单克隆技术出发，探讨其改造策略以及未来发展方向
关键字：鼠源，全人源，单克隆抗体
单克隆抗体是一种由人类通过采用各种化学技术或者人工方式制备，由单一 b 受体细胞的单克隆抗体细胞产生的一种抗体。其高度均一，且仅针对某一特定受体抗原上的表位。单克隆免疫抗体的制备方法主要具有产物纯度高、交叉免疫反应少、制备时间和成本低、结构均一、特异性强等特点，其主要生物学机理功能主要特点是与抗原分子结合后不能产生间接免疫受体分子或直接阻断配体。当前已有40多种单抗体克隆免疫抗体被广泛用于自身自体免疫功能性疾病、肿瘤和器官移植等各个方面，效果显著。
1 全人源单克隆抗体制备技术
自从1975年，KOHLER等人通过杂交瘤技术成功获得了具有抗原特异性的鼠源性单克隆抗体，从而开启了单克隆抗体开发的新纪元。随着多年发展，单克隆抗体已经成为人们疾病诊治的重要工具。而鼠源性抗体来源于小鼠，在对人体使用时，存在着诸多缺陷，为解决此类问题，全人源单克隆抗体被提出，是未来单克隆抗体的主要研究方向之一，目前使用较为广泛的全人源单克隆抗体制备技术有以下几种：
1.1 噬菌体抗体库技术
噬菌体抗体库技术至1990年成功实施以来，经过30年的发展，已经成为该领域应用最广的制备技术之一。噬菌体抗体库技术的应用原理是使用PCR技术（聚合酶链式反应技术），将人体抗体编码的基因序列通过技术进行扩增，然后将抗体的基因序列插入到噬菌体中的适当位置，并通过建立一个噬菌体抗体库，让人体抗体和另一个噬菌体外壳上的蛋白进行相融，将两者互相融合的蛋白质形式展示在噬菌体的表面。噬菌体抗体库技术将通过构建好的抗体库与抗原进行结合，并通过抗原与抗体的差异性相互结合的基因组原理，通过筛选，挑出一种能与目的抗原进行结合的噬菌体，在通过噬菌体基因测序，得到一种新的基因序列,并将其通过基因组技术应用于全人源抗体中。
目前，噬菌体抗体库技术已经构建了多个不同类型的抗体库，并运用在多个临床领域。噬菌体筛选抗体基因库筛选技术的主要特点在于可以筛选出的抗体生命周期短、筛选抗体容量大、基因型和抗体代谢型的形式之间具有高度统一性，通过对新型噬菌体筛选抗体基因库筛选技术的深入研究推广运用，能够分离得到几乎所有的抗原特异性全人源抗体，但其缺点是亲和力较低，难以用于临床治疗，因此，近几年此技术的研究重点也是从增加抗体的亲和力为主，利用多种基因测序技术增加抗体库的多样性，使其能够广泛运用。
1.2 转基因小鼠技术
转基因小鼠技术于1989年被首次使用，研究者将人的基因座转入小鼠体内，通过人体基因与小鼠基因的重排并表达，证明可以利用转基因小鼠制备技术进行人类抗体的研究。目前研究人员通过酵母人工染色体技术和基因敲除技术构建全人源抗体转基因小鼠，并通过产业化运作，极大的推动了治疗性抗体的市场化。
转基因小鼠技术的基本原理是：将相应的基因工程技术运用到小鼠体内，破坏其体内的抗体基因，并将人抗体基因转入小鼠体内，从而获得相应的抗体。该技术通过小鼠进行，在一定程度上，保证了抗体转换的完整性和可选择的多样性以及亲和力，从而使该技术由更好的稳定性。
目前转基因小鼠技术已经有3类，微基因座、人工染色体及转染色体，通过这3类技术的运用，成功利用转基因小鼠技术生产出治疗多种疾病的全人源单克隆抗体，如黑色素瘤、高胆固醇血症等，但是转基因小鼠技术的缺点同样存在，因人与小鼠之间的免疫系统存在差异，后续如何通过技术实现更加性能优良的抗体结构，是该领域研究者的主要研究目标。
1.3 单个B细胞抗体制备技术
单个B细胞抗体制备技术的原理是，从人体的血液、骨髓等进行B细胞的选择，在通过多种技术，将其进行反转录 PCR 扩增抗体基因序列。
此步骤需要在适当容器中进行，比如有适量细胞裂解液、RNA 酶抑制剂的容器，通过对其进行各种形式的测序、酶切并将其连接至原核载体中，在相应的系统中表达、纯化得到全人源抗体，最终用目的抗原筛选和鉴定抗体的特异性、亲和力等生物学特性。
该技术保留了轻重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、所需细胞量少等优势。但在实际应用过程中，B 细胞分选技术和后续 PCR 基因扩增技术是制约单个 B 细胞抗体制备技术应用的重要因素。
2 全人源单抗的改造策略
目前，研究者们通过以下几个方面对单抗的疗效进行优化。
2. 1 亲和力成熟
通过不断优化这些单抗的生物亲和力，能相应地大大提高这些单抗的生物有效性，减少其不良反应。研究者将一些用于构建突变抗体基因库的筛选方法综合应用创新到突变抗体基因库筛选技术中以便构建产生更多的大库存和容量的小型突变活性抗体基因库，或通过模拟体内具有亲和力成熟的显著抗体突变或产生热点性的突变抗体基因组以构建小容量抗体库，从而快速筛选生产出高体内亲和力的特异性突变抗体。
2. 2 糖基化修饰
糖基化酶的修饰作用在人类抗体的免疫功能结构调节中也是起着重要关键作用。大部分保守igg修饰分子仅在每个igfcγ2区域中的asn-297存在一个保守的线性n-糖基化结构修饰分子位点，约20%。在每个igg分子可变区域存有第二个保守n-糖基化修饰位点，所有这个位点都可能位于一个重链。糖基化作用能够直接影响分子fc段的分子结构和化学稳定性，因此，igg的igfcc核糖链对用于抗体与各种免疫受体的最佳有效结合、抗体对各种病原体的有效抑制清除，以及具有治疗性的对抗体的各种临床有效应用都已经是必不可少的。正常情况人体中具有igg的寡糖i和g的fc寡糖主要毒性表现是因为它是具有一个核心细胞末端具有岩藻糖基化的复杂双链核糖体而非天线型，多因为具有核心细胞末端具有岩藻糖的半导体氧化磷酸乳糖的脱氧甲基磷酸化和具有核心末端唾液的磷酸化而不易对其产生异质性。核心内的各种岩藻糖中所含的缺失甲基抗体可显著地作用于相对增强igg的亲和力iadcc，原因主要表现在于人体细胞膜对核心内的各种岩藻糖经各种甲基抗体化合成后所产生缺失的各种甲基抗体与具有igfcγriiia的各种抗体并非亲和力显著反而趋于相对增强。
2. 3 Fc 受体改造
研究者发现一个fc段的受体与多种类型抗体免疫依赖性疾病相关,是多种治疗性疾病抗体免疫药物在诊断治疗疾病过程的其中的一个关键免疫靶点,单抗的一个fc段抗体能够通过受体介导其免疫效应发挥功能从而提升其治疗功效。目前,市售上的治疗耐药性单体双抗多为igg1亚型，其中在fc段不良效应抑制功能较高，然而，有着不同功能结构多样性的单抗igg1同型和igg亚型通过结合增加药物稳定性，如将两种耐药抗体同型的两个氨基酸分子序列结合进行双向交换，以有效提高药物临床应用安全性,减少不良反应事件的可能发生。
3 全人源单克隆抗体展望分析
1986年，美国FDA批准第一个治疗性单克隆进入临床，治疗性单克隆抗体得以实现飞速发展，截止至今，已有70余个治疗性抗体药物被批准使用，包括肿瘤、免疫系统、感染性疾病等多个领域，其中，全人源单克隆抗体已经成为主流研究方向，在进行研究开发与优化时，针对其亲和力、中和性以及减少免疫原性方面，取得了显著效果，但由于技术受限，目前对于此方面的研究，还是存在诸多局限性，随着相关研究的深入和技术开展，后续，全人源单克隆抗体的产业化和技术化将会迎来更好发展，技术也将更加完善，而其产品也会更加丰富，越来越多的全人源单克隆抗体一定能够在人类疾病诊断和治疗领域发挥至关重要的作用。
参考文献
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