刘国锋
上海天祥质量技术服务有限公司， 上海 200233
摘要：对农业部现有检测标准《NY/T 1725-2009 蔬菜中灭蝇胺残留量的测定 高效液相色谱法》进行改善，建立了更为快速准确测定蔬菜中灭蝇胺残留量的方法；蔬菜经盐酸甲醇提取，用强阳离子交换固相萃取柱净化后，以97%（97/3 V/V）乙腈水作为流动相，经C??色谱柱分离，外标法定量。结果表明，灭蝇胺在0.020μg / mL~1.00μg / mL范围线性关系较好，r2（相关系数）高于0.99，在0.02，0.05，0.20mg/kg不同梯度的加标水平下，灭蝇胺回收率均大于80%，方法检出限0.02mg/kg，符合农业部标准NY/T 1725-2009的检出限要求。
关键词：高效液相色谱法，改善，蔬菜，灭蝇胺
Determination of Cyromazine Residues in Vegetables by High Performance Liquid Chromatography
Liu Guofeng、Ding Menglong
（Intertek Testing Services Ltd., Shanghai 200233，China）
Abstract: The existing NY/T 1725-2009 detection method is optimized, and a fast and accurate method for the determination of cyromazine residues in vegetables by high performance liquid chromatography is established. Vegetables are extracted with hydrochloric acid and methanol, and the solid phase is exchanged with strong cations. After purification of the extraction column, 97% (97/3 V/V) acetonitrile water was used as the mobile phase, separated by a C?? chromatographic column, and quantified by an external standard method. The results show that cyromazine has a good linear relationship in the range of 0.020μg/mL~1.00μg/mL, and the correlation coefficient (r2) is greater than 0.99. At different gradients of 0.02, 0.05, 0.20mg/kg, cyromazine has a good linear relationship. The recovery rates are all greater than 80%, and the detection limit of the method is 0.02mg/kg, which meets the detection limit requirements of the Ministry of Agriculture standard NY/T 1725-2009.
Key words：high performance liquid chromatography，Optimization，vegetables，cyromazine
灭蝇胺是一种高效、低毒、强选择性的含氮杂环类杀虫剂，其作用机理是使得蝇类等双翅目昆虫幼虫或其蛹在形态上发生畸变，使其向成虫变化的过程受到抑制或不能完全羽化，从而达到抑制害虫的目的，作为一种高效低毒性的农药现已经大规模用于农业生产，但是研究表明，灭蝇胺在人体中会代谢产生危害人体健康的三聚氰胺。因此该药物不仅需要合理使用，更应对其残留量加以控制。所以很多国家都对灭蝇胺的残留量有严格的要求[1]。在中华人民共和国食品安全国家标准GB 2763-2019食品中农药最大残留限量[2]中，也对多种食品中灭蝇胺的残留最大限量做出了明确规定，但是其中杂粮谷物，丝瓜、苦瓜、茄子等均未有明确的限量要求，多地也曾报道果蔬中灭蝇胺残留量检测超标的新闻，其中也不乏上述提及的杂粮瓜果等，所以建立更完善的监管标准势在必行。另外一方面灭蝇胺在果蔬中的残留量很低，其准确的检测方法也是研究的一个方向，唯有加强监管和提高测试准确性两措并举才能为农产品安全保驾护航。
目前灭蝇胺的检测方法主要有高效液相色谱法、高效液相串联质谱法等[3-6]，国家农业部也出台了相关的检测标准NY/T 1725-2009[7] ，提供了蔬菜中灭蝇胺残留量的高效液相色谱检测方法。但是该方法在实际的测试中存在以下几点缺点：实验过程繁琐费时；样品回收率低；且前处理除杂有限，灭蝇胺易受杂质干扰等问题。尤其是在样品的提取时，需要称取20g样品，且使用的提取液提取效果低，这已经使得整个的提取效果大打折扣；后续只吸取提取液体积的1/10进行后续处理，吸取过程带来的损失也不可避免；再则该方法需要使用旋蒸蒸发仪来浓缩提取液，会使得目标物再次损失；最后方法中固相萃取时使用了15mL洗脱液进行洗脱，洗脱液使用体积过大造成了浓缩复溶的步骤也变得困难；如再次使用旋蒸复溶又会使得目标损失，而大量的洗脱液使得采用直接氮气吹干的时间过长。不仅如此，灭蝇胺还受到不同基质的影响[8]，除杂不完全或者杂质引入的都会干扰测试结果，使结果更加的不稳定的。
所以如何对于农业部NY/T 1725-2009方法的优化成了灭蝇胺残留量检测的关键一步，本文通过实验并结合数据为蔬菜中灭蝇胺的残留量快速准确测定提供参考。
1．实验
1.1试剂耗材
Thermo Fisher U3000高效液相色谱仪器，配有二极管阵列检测器（美国赛默飞公司）；分析天平（精确到0.1mg，MELLER TOLEDO）；分析天平（精确到0.01mg，MELLER TOLEDO）；超声波清洗器（KUDOS）；涡旋仪（上海安谱）；氮吹浓缩仪（上海安谱）；固相萃取装置（SUPELCO）；高速冷冻离心机（菲恰尔）；强阳离子交换萃取柱（纳谱分析SelectCore ，SCX：500mg/6ml）； ChormCore NH?-L（250m*4.6mm，5μm，纳谱分析），甲醇（色谱级，CNW）乙腈（色谱级，CNW），盐酸（优级纯，国药），氨水（优级纯，国药）。样品为市售豇豆、青菜、茄子。
提取液：吸取200mL甲醇，使用盐酸溶液（8.5mL盐酸，用水定容至1L容量瓶中）定容至1L容量瓶中。
洗脱液：5%氨水甲醇溶液（5mL氨水，用甲醇定容至100mL容量瓶中）。
1.2标准品配制及储存
标准物质名称：灭蝇胺；标准物质英文名称：Cyromazine；标准物质CAS号： 66215-27-8。
标准储备液的配制：准确称取0.01g（精准至0.0001g）灭蝇胺标准品（Dr.Ehrenstorfer 纯度99.26%）用乙腈溶解并转移至10ml容量瓶中，再用乙腈溶解并定容至刻度，得到质量浓度约为1000mg/L的灭蝇胺标准储备液。储于 -20℃～-16℃冰柜中备用，储备液有效期12个月
标准溶液中间液的配置：用乙腈稀释灭蝇胺标准储备液，得到质量浓度为1.0mg/L的中间液，中间液有效期6个月
标准工作液：分别吸取标准中间液配制成约为0.020μg / mL、0.040μg / mL、0.100μg / mL 、 0.200μg / mL、 1.00μg / mL，工作溶液临用前配置。
1.3实验设计
选择豇豆、青菜、茄子三种不同的蔬菜样本进行加标回收实验，分别添加0.020，0.050，0.200mg/kg三组不同水平浓度，其中0.020mg/kg为农业部标准NY/T 1725-2009所要求的方法检出限。每种样本的每组浓度进行6平行实验，外标法定量并计算加标回收率。
1.4样品前处理
提取：准确称取2g已均质的样品于离心管中（精确至0.1mg），加入提取液10mL，振荡或涡旋混合1min，再超声提取10min，以4000r/min离心10min，静置后吸取上清液，残渣重复提取两次，合并三次上清液备用，待净化。
净化：SPE柱活化：依次用5.0 mL甲醇、5.0 mL水活化；上样：加入已制备好上的全部上清液，重力过柱且控制流速约1秒1滴左右，弃去所有流出液；淋洗：依次用5.0 mL水、5.0 mL甲醇淋洗，撇去淋洗液，抽干SPE小柱；洗脱：用6.0 mL5%氨水甲醇洗脱液洗脱，收集全部洗脱液，并于50℃氮气下吹干，再用2mL 97%（97/3 V/V）乙腈水溶液溶解残留物，然后超声、涡旋混合，最后过0.45μm微孔有机滤膜，以备高效液相色谱分析测定。
1.5高效液相色谱仪器条件
色谱柱：ChormCore NH?-L（250m*4.6mm，5μm）
流动相：乙腈：水（97+3）
流速：1.0mL/min等度洗脱15min
进样量：50μL
柱温：30℃
检测波长：二极管阵列检测器，波长245nm，同时采集光谱图
2．结果与讨论
2.1图1为灭蝇胺标准物质色谱图，图2为灭蝇胺光谱图，图3为灭蝇胺曲线线性图，图4为豇豆空白样品图，图5为豇豆检出限加标图，表1为不同基质样品的加标回收
图1 灭蝇胺标准物质色谱图
图3 灭蝇胺曲线线性图
图4 豇豆空白样品图
图5 豇豆检出限加标图
标准物质 样品基质 加标浓度
（mg/kg） 实际加标回收率（%）
灭蝇胺 豇豆 0.020 83.54
0.050 85.88
0.200 88.44
灭多威 青菜 0.020 82.44
0.050 83.78
0.200 85.14
灭多威 茄子 0.020 84.57
0.050 86.98
0.200 89.41
表（1） 不同种类样品加标收率
2.2实验注意事项
（1）实验过程应包含样品双平行实验，全过程空白实验，及样品加标实验，灭蝇胺标准品工作溶液现配现用，外标法定量。
（2）前处理过程中，固相萃取柱应全程控制流出速度于1秒左右1滴，能有效使目标物与固相萃取更有效结合洗脱，提高测试的回收率与准确性；另外按照上述方法测定的样品和标准品的工作溶液浓度应在仪器检测的线性范围内，否则需要将溶液做进一步稀释，使得被测溶液浓度在线性范围以内。
（3）在相同实验环境下，试样中被测物质的保留时间与标准工作溶液的保留时间偏差在±2.5%内；同时使用二极管阵列检测器比对其光谱图，match值大于900时，则可确定样品中存在该待测物。
2.3.讨论
（1）本试验测试方法相比农业部NY/T1725-2009的前处理方法采用盐酸甲醇溶液进行提取，提取效率更高，另外只采用标准1/10的样品的称样量，使得提取更加充分，结果更加稳定。
（2）除了提取方法，后续操作也同样进行了优化。样品的提取液全部上样至固相萃取柱上，避免了因只吸取部分提取也而导致的损失问题，再使用一定量的提取液清洗离心管和残渣，相比于农业部NY/T1725-2009使用旋转蒸发仪浓缩后再清洗复溶带来的蒸发损失和溶解不完全，现在的操作更加的快捷简便，溶剂使用和浓缩量更少，使得后续可以使用氮吹浓缩的方式，使得测试结果准确，并且检测流程便捷。
（3）对豇豆、青菜、茄子的加标实验结果表明，本方法能够满足一般蔬菜中灭蝇胺的检测要求，符合农业部NY/T1725-2009的检出限要求，并且灭蝇胺在上述3种不同基质样本中回收率均大于80%（n=6）,RSD在1.1%~12%(n=6)之间,满足GB/T 27404-2008《实验室实验室质量控制规范》附录F中对于回收率在60%~120%和相对标注偏差（relative standard deviation RSD）小于21%的要求
3.结论
本文参考较多的文献资料建立了蔬菜中灭蝇胺的测试方法[9-12]，对农业部标准NY/T 1725-2009的测试方法进行了优化不仅能满足标准的检出限要求，也使得整个前处理过程更加的简便快捷，结果稳定准确。另外多种基质的验证结果也显示该方法适合一般蔬菜，不同基质的回收率整体都较高。相比标准具有更明显的优势，能够对样品进行快速准确测试，对样品测试量大的实验室具有一定的参考价值。
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的残留