刘桂元
宁乡市市场监督管理局 湖南省长沙市宁乡市 410600
摘要：脱氢乙酸及其钠盐是一种常用的食品防腐剂，当前研究表明其对于人体健康有一定的影响，因此加强对其检测，确保其添加量在限量值范围内具有重要意义，本文基于国标方法，对高效液相色谱法测定食品中脱氢乙酸含量的方法进行了优化，可以提高食品中脱氢乙酸检测的效率和准确性。
关键词：高效液相色谱仪；食品；脱氢乙酸；食品安全
1 引言
脱氢乙酸及其钠盐是一种常用的食品防腐剂，分子式为C8H8O4，在常温状态下为无色结晶或者浅黄色粉末，难溶于水，在碱的水溶液中溶解性较好，能溶于苯、甲醇和丙酮等有机溶剂。脱氢乙酸具有广谱、低毒、高效等特点，对酵母菌、霉菌等有较强的抑制能力，常用于果汁、糕点、酱菜和腐乳等食品的防腐中，具有良好的防腐效果，在酸性条件下有良好的防腐效果，但在碱性条件下基本无法起到防腐作用。而脱氢乙酸及其钠盐容易被人体吸收，从而被分散到器官和血液之中，对人体内多种氧化酶起到抑制作用，从而对人体的肾脏、肝脏和中枢神经等造成威胁，使得脱氢乙酸的安全性受到了质疑。当前各国对脱氢乙酸的使用都进行了明确的限制，欧盟禁止脱氢乙酸使用；美国规定脱氢乙酸的最高残留限量为65mg/kg；日本规定，黄油、奶酪等食品中脱氢乙酸最高残留限量为0.5mg/kg；我国GB 2760-2014 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准中规定，在腌制蔬菜和淀粉制品中脱氢乙酸的限量为1.0mg/kg；在黄油、糕点、果汁、肉制品中的限量为0.3~0.5mg/kg。
在GB5009.121-2016中对脱氢乙酸的检测方法进行了规定，包括气相色谱法法和液相色谱法两种方法，其中气相色谱法检测方法比较复杂，受到的影响因素多，重复性差，因此在实际检测方法中，通常应用高效液相色谱法来进行食品中脱氢乙酸及其钠盐的检测，但是根据国标给定的仪器条件进行检测，不仅前处理过程复杂，而且色谱峰存在拖尾的问题，影响定量结果的准确性。因此，本文对脱氢乙酸及其钠盐检测方法的前处理和色谱条件进行了优化，改善了色谱峰拖尾的问题，同时使前处理更加简单方便，检测效率得到了有效的提升。
2 材料与方法
2.1 仪器和试剂
实验中所用仪器如下：LC1200高效液相色谱仪，配置紫外检测器（安捷伦科技（中国）有限公司）；AUY220电子天平（日本岛津有限公司）；PHS-3C型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；VCK-22R高速离心机（湖南迈克尔实验仪器有限公司）；KM-500DV超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）。
实验中所用的试剂：甲醇中脱氢乙酸（c=1000mg/L，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限公司）；甲醇（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；乙酸铵（优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；硫酸锌、氢氧化钠（分析纯，天津永大化学试剂有限公司）；正己烷（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；氨水（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；实验室用水为超纯水。
2.2 试验方法
2.2.1 溶液配制
脱氢乙酸标准溶液配制：移取1000μg/mL的脱氢乙酸标准储备液2.00ml于10ml容量瓶中用水定容，配制成浓度200mg/L脱氢乙酸标准中间溶液；分别移取200μg/mL脱氢乙酸标准中间溶液0.025、0.125.、0.25、0.50、1.25、2.50ml于5ml容量瓶中，用水定容至刻度，配制成浓度分别为1.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100μg/mL的脱氢乙酸标准系列溶液，4℃保存。
硫酸锌溶液配制：准确称取60g硫酸锌于烧杯中，加入水搅拌溶解，溶解完全后转移到500mL容量瓶中，用水定容，配制120g/L的硫酸锌溶液。
乙酸铵溶液：准确称取0.77g乙酸铵于烧杯中，加入水搅拌溶解，溶解完全后转移到500mL容量瓶中，用水定容，配制0.02mol/L的乙酸铵溶液。
氢氧化钠溶液：准确称取10g氢氧化钠于烧杯中，加入水搅拌溶解，溶解完全后转移到500mL容量瓶中，用水定容，配制20g/L的氢氧化钠溶液。
甲酸溶液：量取10mL甲酸，加水90mL，混匀，配制10%的甲酸溶液。
2.2.2 样品前处理
脱氢乙酸在常用于果汁、糕点、酱菜和腐乳等食品的防腐，本实验以从超市随机购买的面包、饼干作为样品，其中包括标注未使用脱氢乙酸和标注使用了脱氢乙酸。将样品打开包装，用粉碎机粉碎，准确称取2g样品（精确到0.001g）于50mL离心管中，依次加入10mL纯水、5mL硫酸锌溶液，然后用氢氧化钠溶液调节pH，当 pH计示值为7.5时停止，然后加入纯水使离心管刻度达到25mL，摇匀。将离心管转移到超声波清洗机中，超声提取30min，然后将液体转移到分液漏斗中，加入10mL正己烷，振摇1min，静置，待完全分层从分液漏斗上方去弃去正己烷，在加入10mL正己烷重复1次，将下层水相放入到离心管中，以10000r/min离心5min。取上清液1mL过0.45μm水膜到2mL进样小瓶，供高效液相色谱测定。
2.2.3 色谱条件
色谱柱： C18柱(150mm*4.6mm,5um), 流动相：甲醇：0.02mol/L乙酸铵=5:95，流速1.0mL/min；检测波长：293nm。柱温30℃，进样量10μL。
3 结果与分析
3.1 前处理方法
通过实验研究发现，按照GB5009.121的前处理方法对面包、饼干等烘焙食品进行处理，即先用超声提取10min，正己烷萃取后，4000r/min离心10min，样品在离心之后分层不清晰，尤其是样品中含有大量奶油和巧克力时很难实现良好的分层，而且回收率偏低，低于70%的情况比较普遍。基于这种情况，本文采用控制变量法对对超声时间和离心速度进行了优化，结果显示，在超声时间在30min、离心机转速在10000r/min时，其回收率可以达到90%以上，具有良好的效果。
3.2 检测波长优化
脱氢乙酸在231nm处吸收峰最强，在293nm处吸收峰仅次于231nm处。在食品中，苯甲酸、山梨酸是常用的添加剂，这些物质在225nm附近处有强吸收峰，因此若选择231nm波长，在实际检测中会很容易受到干扰，基于此本文试验中选择293nm作为检测波长。
3.3 流动相
脱氢乙酸的解离常数为4，属于弱电解质，为了使其峰形对称，需要使其处于完全解离或者完全不接力状态。本实验中选用甲醇；0.02mol/L乙酸铵（5:95）作为流动相，通过甲酸和氨水调节pH，使其pH分别为2.50和9.00，将结果和不调节pH的结果进行对比，结果显示若不调节pH，脱氢乙酸峰形最差，甚至不出峰，在酸性和碱性条件下都可以得到对称的峰形，而在样品检测过程中，发现在酸性流动相条件下脱氢乙酸出峰时间有杂峰干扰，而更改流动相比例和速度来调整脱氢乙酸出峰时间，其峰形会变差，因此最终选择了碱性的流动相条件，采用耐碱色谱柱，甲醇；0.02mol/L乙酸铵（5:95），用氨水调节pH到9.00，进行实验。
3.4 方法线性范围和检出限
以脱氢乙酸的浓度为横坐标，响应值为纵坐标绘制标准曲线，结果显示在1.00~100μg/mL的浓度范围内，浓度和响应值之间的线性关系良好，相关系数达到0.9995。以空白基质为溶剂，逐级稀释脱氢乙酸，进行检测，以3倍信噪比确定该方法下脱氢乙酸的检出限，最终确定仪器上检出浓度为0.1μg/mL。根据实验条件可知，样品溶液的总体积为25mL，称样量为2.0g，确定方法的检出限为1.25mg/kg，定量限为4.17mg/kg。
3.4 方法回收率和精密度
以不含脱氢乙酸的样品作为空白样品，进行添加回收率试验，添加浓度分别为2μg/g、5μg/g和10μg/g，每个浓度做5个平行，回收率范围在90.1%~106.5%，相对标准偏差的范围是2.51%~7.25%。
结论
本文以面包等烘焙食品为样品，对样品中脱氢乙酸的前处理方法、流动相条件和检测波长进行了优化，通过进行优化，有效的提高了样品中脱氢乙酸的检出限、定量限、线性范围、相关系数和精密度等参数均可以满足样品检测的要求。
参考文献
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