洪维奎
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摘要：基因编辑技术是可以对致病基因作为靶标，对此进行替换、修复、补充等操作以达到治疗疾病的目的，通过化学合成的核酸以及进入体内表达的核酸的主要靶向致病性RNA[1]。而在体内表达的过程中为免去其他杂质或者蛋白的干扰，让体内表达过程顺利进行，需要对过程中的核酸进行提纯和分离，本文简要综述寡聚核酸的生产研究进展。
关键词：核酸合成 分离纯化 离子交换
一、前言
全世界的科学家就核酸方面做了大量研究工作, 证明核酸是生物学方面的头等重要的物质,也是医学范围内的重大问题, 因为核酸不仅仅是细胞核和细胞质的重要组成部分,而且跟物质代谢的各个环节中都有着直接重要的关系。它与生长过程、繁殖、遗传变异、蛋白质的合成都是密切相关的。一些重大的疾病比如病毒、肿瘤等都与核酸相联系, 所以说目前核酸已成为世界上生物化学、生物物理学、分子生物学和核酸化学等各个不同学科里的重要课题[2]，特别是编码RNA(mRNA)、非编码RNA（miRNA）,siRNA以及反义核酸（ASO）等领域。
二、核酸作用机理
小核酸作用机理即RNA干扰(RNAi)技术，通过阻碍或者沉默特定基因的翻译或转录，从而达到抑制致病蛋白质的合成，这样就可以从基因水平治疗疾病[3 ]。
三、核酸合成
核酸的化学合成法经历了半个多世纪的发展，从开始的磷酸二酯法、磷酸三酯法到氢磷酸法和亚磷酰胺法，在接下来做简单的介绍。
1、磷酸二脂法
在20世纪50年代初期，化学合成核酸的方法最先开始使用的是磷酸二酯法，直到60年代后半期才逐渐被磷酸三酯法所取代。Khorana和他的合作者们通过核苷磷酸单脂和其他有自由羟基的核苷或者核苷酸来进行缩合反应，一般以二环己基碳二亚胺（DCC）或者对甲苯磺酰氯（TsCl）作为缩合剂[4]。
Khorana在使用这种方法的时候，对碱基和糖环上的活性部位做了保护基进行保护，而磷酸基团却没有进行保护，这就使得磷酸键上的支链仍然能参与其他反应。随着反应的持续，在链增长的过程中副反应也就越来越多，最终导致反应的产率急速下降。所以磷酸二酯法在1970年的时候就逐渐被放弃使用了。
2.磷酸三酯法
在上世纪的后半段时期，磷酸三酯法逐渐被科学家们发展起来。
Letsinger和Mahadevan在对2－氰乙基对磷酸酯键进行保护后，开始在固相合成上使用磷酸酯法来进行核酸合成。
通过对磷酸三酯法的运用，科学家们合成了一系列10－15mer的寡脱氧核糖核酸，采用酶催化的方式对这些寡核酸链进行连接，得到了人胰岛素基因序列的A链和B链，并且成功表达。与此同时，对核糖核苷2’－OH保护研究进展促使了RNA化学合成的实现，例如1981年Eiko Ohtsuka等人采用类似的方法，完成了大肠杆菌甲硫氨酸tRNA的合成[5]。
3.氢磷酸法
氢磷酸法的核酸化学合成是20世纪50年代由Todd的课题组第一次报道出来。氢磷酸的磷脂比磷酸三脂法的五价磷反应活性更高，缩合速度更快，而且氢磷酸核苷单体更容易合成。由于氢磷酸法存在氢磷酸单体在溶液中容易水解，存在不易保存和操作等问题，曾经很长一段时间，它主要是运用在固相合成上。直到Van Boom和他的合作者们针对此类方法做了新的改良即在核苷氢磷酸盐与羟基组分反应后，立即加入活性很高的芳香硫化物，可以得到稳定的磷酸三脂产物。此次改良没有改变氢磷酸脂法缩合反应的高活性，同时还具有和磷酸三酯一样的稳定性，从而使得氢磷酸法在液相合成中也得到了广泛运用。
4.亚磷酸酰胺法和固相合成法
在1978年，Letsinger和Lunsford报道3价磷比5价磷具有更高的缩合活性，为此他们设计了在-78℃下二氯亚磷酸脂与核苷糖环3’－OH反应，得到的亚磷酸二脂无需分离即可与另一核苷的5’OH发生缩合，生成亚磷酸三脂，再通过氧化剂碘将3价磷氧化成5价磷，得到了稳定的磷酸三脂结构，这就是亚磷酸酰胺法。但是在这种方法里，仍然存在较大的缺陷，那就是第一步反应生成的亚磷酸二脂剩下的一个亚磷酸酰氯同样具有很高的活性，这样也就不可避免的生成3’－3’或者5’－5’产物。直到1981年，送个难题被Beaucage和Caruthers所解决。
他们通过引入单活性官能团的亚磷酸酰胺与3’－OH核苷反应生成核苷亚磷酸酰胺，然后在1H－四氮唑催化下，核苷亚磷酸酰胺能够快速与另一核苷的5’－OH核苷进行反应。亚磷酸酰胺的引入，避免了3，－3，或者5，－5，的产物，因此产率极高，这一方法就是亚磷酸酰胺法。
亚磷酸酰胺法以其独有的特点，后来逐渐发展成为固相合成核酸的主流方法。固相合成法即整个合成反应需要在特定的反应容积中，所有的化学反应均在固相载体上进行，通过一个个核苷酸单体的链接，从而合成出所需要的序列和长度。亚磷酸酰胺法的固相合成，毎加一个特定序列的核苷单体，基本上都要经历脱除５’端保护基、缩合、盖帽和氧化这四步，依次循环进行，核酸的链可逐步延长。合成结束后，通过脱保护反应可以将寡核酸链与固相载体的连接切除，并且脱除磷脂、碱基以及2’-OH上的保护基团从而得到所需的核酸链。固相合成法合成核酸技术到今天已经相当成熟，实现仪器的全自动合成，并且产能上满足了研究级别到商业级别的样品需求，为人们研究核酸、研究生命科学提供了巨大的便利。
四、核酸的分离纯化
全球主流的大规模合成系统大多为Cytiva的Oligo系列核酸自动合成仪，运用过流合成技术（Flow-through）进行固相合成，经切割及脱保护反应后获得目标产物。在序列合成的结束可选择是否切除DMTr保护基团，根据合成的选择确认不同的分离方式。美国Ionis公司采用反相色谱进行纯化，利用DMTr保护基团的极性与杂质的区别来进行分离，后经过正丁醇沉淀，脱出保护基团，得到目标产品。美国Avecia公司采用的阴离子交换色谱进行纯化，后经超滤脱盐、冻干后得到目标产物。国内的大规模合成的公司暂时不多，除常州合全药业可以达到公斤级生产外，其他诸如广州锐博生物技术有限公司、南通百奥生物技术有限公司的产能均不高。
1色谱纯化方式
阴离子色谱纯化产生的水相废液归集和处理非常方便，一般D级洁净车间就可以满足纯化生产需求。高盐洗脱得到的合格样品溶液与超滤系统兼容性好，可以直接补加注射用水超滤脱盐浓缩，电导合格后就可以进行冻干工序。目前阴离子交换色谱和超滤的纯化工艺设计符合项目开展和生产实际需要，质量安全和环境友好，可以连续地进行小试中试及放大等各个规模的纯化生产。虽然反相色谱纯化有分辨率及选择性更高等特点，但考虑其需要专门的高压系统及DAC装柱设备，操作压力高。反相流动相要使用到离子对试剂如三乙胺等，采用有机溶剂洗脱如甲醇、乙腈等，其多为有动物致癌性的二类溶剂。纯化生产使用的溶剂量很大，价格昂贵，车间需要做专门的防爆处理。而且超滤浓缩膜包大多不能耐受超过10%有机相比例的反相收集合并样品，需要专门的减压旋转蒸发等脱溶剂步骤，增加了生产环节的投入，产生的有机废液也较难处理，纯化工艺路线选择采用阴离子色谱法进行纯化。
2色谱填料
从层析分离成本、填料的载样量等方面考虑，目前核酸分离的主流仍然是阴离子交换色谱层析。而目前市场上应用较多的属于Cytiva的两款填料，分别是Source 15Q和 Q Sepharose Fast Flow。
根据不同的合成方式可选择不同的填料对核酸进行纯化，Q Sepharose Fast Flow具有柱效低（最佳的装填柱效为3000~5000）以及载量高等特点，可用于带DMTr的全长序列与杂质序列的分离。Source 15Q具有高分辨率，最佳填装柱效在20000左右，但载量较低，可用于分离N-1、N-X以及N+1、N+X等杂质。在实际核酸分离过程中可以两者结合使用也可以单独使用以获得合成的核酸序列。
五、结语
近年随着越来越多的核酸药物研发的深入，不断有核酸新药进入临床。而国内的API生产能力以及工艺开发能力却未跟上国际水平，因此在未来的时间内，国内的核酸药物研发公司应积极与其他国家的公司加深合作，以此来提高API的工艺开发能力。
参考文献：
[1]何军林.核酸药物研究[J].国际药学研究杂志，2017,12（44）：1028-1051.
[2]李棣生.核酸与生命[J].化工之友，2001（1）:10-12.
[3]寿晶，刘姝晶，陈燕等.小核酸制药产业发展模式探索[J].中国药业，2014,23（22）：1-4.
[4]Khorana H.G;Razzell W.E.;Gilham R.T.,et al.Synthesis of dideoxy ribo nucleotides.Journal of the American Chemical Society 1957,79,1002-1003.
[5]Ohtsuka E.;Tanaka S.;Tanaka T.,et al. Total synthesis of a RNA molecule with sequence identical to that of Escherichia coli formylmethionine tRNA.Proceedings of the National Academy of Sciences 1981,78,5493-5497.
作者简介：
洪维奎（1985—），男，汉族，本科，单位：苏州瑞博生物技术股份有限公司，研究方向：核酸生产工艺